【摘 要】
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本研究首先从绒山羊白细胞中提取基因组DNA,依据已发表的哺乳动物KAP基因序列设计两对引物P1/P2和P3/P4,采用PCR技术扩增基因组DNA,分别获得目的基因片段S1和S2。通过T4DNA连
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本研究首先从绒山羊白细胞中提取基因组DNA,依据已发表的哺乳动物KAP基因序列设计两对引物P1/P2和P3/P4,采用PCR技术扩增基因组DNA,分别获得目的基因片段S1和S2。通过T4DNA连接酶将目的基因连接于克隆载体pGM-T的SacⅡ和Not I位点,然后再经过感受态TOP10的转染、质粒DNA的提取、限制性酶切分析以及测序分析后,成功克隆了绒羊KAP基因两部分基因片段,分别为S1和S2。其中S1含有289个核苷酸,S2含有304个核苷酸,其中KAP6.1编码71个氨基酸残基组成的多肽。序列分析发现,S2片段的编码蛋白包含具有KAP6家族特有的氨基端结构域MCG(S/-)YY(G/R)NY和羧基端结构域GS(G/S))F/-)(G/-)YY(Y/-)。序列同源性分析表明,绒山羊两个KAP基因的核酸序列在不同哺乳动物之间有很高的同源性,分子在进化上均相当保守。其次对检测SNPs的PCR-SSCP分析方法进行了探讨,以304bp的PCR产物为例在凝胶组成、浓度、上样缓冲液的组成、甘油的比例以及电泳的条件等方面进行了优化,建立了一种片段在300bp左右的PCR-SSCP分析方法。以KAP为候选基因,以内蒙古白绒山羊为实验材料通过PCR-SSCP分析技术对其两个基因片段进行对比分析。PCR-SSCP结果表明:其中在角蛋白辅助蛋白的多基因家族中的甘氨酸酪氨酸角蛋白辅助蛋白(KAP6.1)中,位点S2与产绒量有显著的差异性(P<0.05)。在甘氨酸酪氨酸角蛋白辅助蛋白(KAP6.1)中,位点S2的AA基因型和BB基因型与产绒量之间有显著的差异性(P<0.05);AB基因型和BB基因型的绒细度之间差异的显著(P<0.05)。
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