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非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85%,是癌症致死的主要原因之一。75%的患者发现时已处于中晚期,转移后生存率较低,多在一年内死亡。2004年,研究发现NSCLC与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变有关,之后作用于受体胞内的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)和作用于受体胞外的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)被广泛用于临床治疗。然而,TKI和mAb联合应用会导致一系列不良反应,严重时需中断治疗。本研究采用EGFR-TKI类药物阿法替尼(afatinib,AFT)作为模型药物,包载在脂质体内,人鼠嵌合型抗体类药物西妥昔单抗(cetuximab,CTX)作为靶头修饰在脂质体表面,旨在构建主动靶向于NSCLC的新型递药系统。采用硫酸铵梯度法制备阿法替尼脂质体(liposome,LP),与巯基化的CTX共孵育制备免疫脂质体(LP-CTX)。使用两种NSCLC细胞系进行体外评价,以研究CTX-EGFR结合对脂质体靶向性的影响。建立AFT的LC-MS/MS的测定方法,在大鼠体内研究其药代动力学,在NSCLC异种移植小鼠中研究其组织分布和肿瘤抑制作用。1.AFT-LP的制备先后采用薄膜分散法、逆向蒸发法、改良的乙醇注入法和硫酸铵梯度法制备脂质体,通过葡聚糖凝胶微柱离心法纯化脂质体,采用紫外分光光度法测定脂质体的包封率,以包封率和粒径作为评价指标,最终确定用硫酸铵梯度法制备脂质体。通过单因素考察和响应面分析进一步优化处方工艺参数,以确定AFT-LP的最佳制备方法。用最优处方制得的AFT-LP包封率为90.25%±8.42%,粒径为112.5±1.8 nm。2.AFT-LP-CTX的制备采用与过量的Traut’s试剂反应使CTX巯基化,经超滤管离心纯化后与LP共孵育,并以连接效率和粒径为指标对关键因素进行考察。当CTX与磷脂的摩尔比例为1:500,孵育时间为20 h时,单抗与脂质体的连接效率约为70%,粒径约为117 nm。用琼脂糖凝胶CL-4B柱对LP-CTX进行分离纯化鉴定,并与游离单抗的洗脱曲线对比,结果表明单抗与脂质体成功连接。3.LP与LP-CTX的表征采用透射电镜观察LP和LP-CTX的形态,通过动态光散射法测定其粒径和zeta电位,并计算包封率与载药量。LP和LP-CTX的形态圆整,粒径较为均一,平均粒径均在110 nm左右,无明显差别。其包封率均在90%左右,载药量在7%左右。CTX的加入使脂质体的电位由略带负电转为略带正电,有助于发挥主动靶向肿瘤的作用。分别考察了LP和LP-CTX在PBS和含50%胎牛血清的PBS中的释放度,两种制剂的释放曲线相似,释放平缓,在24 h均释放40%左右,未见突释现象。在含有血清的释放介质中,起始阶段的释放速度虽有增加,但是释放总量相当。4.LP与LP-CTX的体外细胞评价采用MTT法,考察了AFT溶液,LP和LP-CTX对非小细胞肺癌原生细胞系A549和获得性耐药细胞系H1975的毒性作用。采用DiL标记LP和LP-CTX并考察了两种细胞对制剂的摄取作用,同时考察了EGFR在摄取中的作用。结果表明,LP-CTX具有较强的毒性作用和细胞摄取作用。通过与游离CTX的竞争靶点证明了主动靶向是通过与EGFR特异性结合实现的,使用CTX预处理可将LP-CTX的细胞摄取降低至与LP类似的水平。5.AFT液质联用测定方法的建立建立以阿法替尼双马来酸盐为标准品的液质联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)测定方法,采用Agilent Eclipse XDB-CN色谱柱(100×2.1 mm,3.5μm)进行分离,流动相为含0.1%甲酸(formic acid,FA)的水:含0.1%FA的甲醇(15:85),流速为0.5 mL/min,线性范围为0.5~200 ng/mL。根据FDA生物样品测定的指导原则,对测定方法的专属性、标准曲线、定量下限、精密度与准确度、回收率、基质效应,稀释效应以及稳定性进行了验证,此方法符合FDA的各项验收标准。6.LP与LP-CTX的体内动物评价用建立的LC-MS/MS测定方法,测定AFT溶液,LP以及LP-CTX在大鼠体内不同时间间隔的血药浓度并计算药代动力学参数。建立荷瘤小鼠模型,研究制剂在小鼠体内的组织分布和肿瘤抑制作用,并尝试用DiR标记LP和LP-CTX,用小动物活体成像来追踪两种制剂在体内的分布情况。结果表明,在健康大鼠体内,LP和LP-CTX的最高浓度是AFT溶液的近400倍,两种制剂的药时曲线相似。在荷瘤小鼠体内,LP-CTX在肿瘤中积累相较于LP较多,滞留时间较长,肿瘤生长抑制率最高。但是在小动物活体成像实验中,DiR在小鼠体内的分布与AFT的组织分布测定的结果并不完全一致。原因可能是从脂质体中游离出来的DiR仍具有荧光作用,且容易在肝脾部位积累,并不能完全代表AFT在体内的分布情况。本研究设计将CTX与AFT载药脂质体相连,制备并评价了一种主动靶向EGFR的新型药物递送系统。研究表明,LP-CTX在NSCLC细胞系中的摄取显著增加。在健康大鼠体内,脂质体的半衰期延长,血药浓度增高,为降低给药剂量从而减少药物的不良反应提供可能性。在NSCLC异种移植模型中,表现出较强的药物递送能力和对肿瘤的生长抑制作用。因此,EGFR靶向的免疫脂质体递药系统在非小细胞肺癌治疗中具有潜力,为日后靶向制剂的开发提供例证。