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目的:骨髓间充质干细胞移植被认为是一种安全有效的缺血性心脏病的治疗方法。越来越多的证据显示BMSCs移植对心肌梗死有疗效。但缺血、缺氧、炎症等导致移植细胞的存活率低,从而限制了其疗效。因此,促进骨髓间充质干细胞的增殖和存活对于提高骨髓间充质干细胞移植疗效具有重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）是促进血管生成因子,促进血管内皮细胞的增殖、迁移和存活。有研究表明,VEGF在心肌梗死后可增加血流,改善心功能。而且,VEGF在心肌梗死后BMSCs移植中也起着关键作用。因此,调节VEGF的分泌可能会影响BMSCs移植的疗效。梓醇（Catalpol）是从中药地黄中分离出来的一种活性化合物,据报道具有广泛的生物学活性,包括降血糖、神经保护、抗衰老、抗肿瘤作用。此外,之前的一项研究表明梓醇可促进大鼠脑卒中模型中VEGF介导的血管生成。研究还表明,梓醇能促进多种细胞的存活和抑制细胞凋亡。根据上述背景,我们推测梓醇在心肌梗死中可能提高BMSCs的生存和VEGF的分泌、提高移植疗效。在这项研究中,我们探索梓醇能否保护BMSCs对抗缺氧缺血性损伤,以及移植到心肌梗死大鼠后,是否促进心肌梗死大鼠的疗效。研究方法:1、BMSCs的分离培养和鉴定从4周大的Wistar大鼠的胫骨和股骨中分离出BMSCs。培养至P3代后,分别与CD44、CD90、CD45、CD34抗体孵育,流式细胞仪鉴定。2、梓醇预处理氧糖剥夺（OGD）条件下的BMSCsBMSCs与不同浓度12.25μg/毫升（L）,24.5μg/毫升（M）,或49μg/毫升（H）)的梓醇预处理24小时。之后,将BMSCs氧糖剥夺12小时。氧糖剥夺条件:在不含血清,葡萄糖及丙酮酸钠的DMEM/F12培养基中培养于95%N2和5%CO2气体条件下。正常对照组细胞在完整的DMEM/F12中正常条件下培养。3、CCK-8检测CCK-8检测梓醇对氧糖剥夺的BMSCs的存活的影响。按实验分组将细胞接种于96孔培养板中。之后进行24小时梓醇预处理和12小时氧糖剥夺培养,每孔10μl CCK-8,置于37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h,在酶标仪上测定其在450 nm处OD值,进行数据分析。4、膜联蛋白V/PI测定细胞凋亡采用膜联蛋白V/PI试剂盒测定细胞凋亡。不同分组（BMSCs、BMSCs+OGD、BMSCs+OGD+梓醇低组、BMSCs+OGD+梓醇中组、BMSCs+OGD+梓醇高组）的细胞,按细胞凋亡检测试剂盒说明书要求,加入5μl膜联蛋白V-FITC和加入10μl Propidium Iodide混匀,室温避光温育15 min,随即进行流式检测。5、ELISA检测根据大鼠血管内皮生长因子（VEGF）ELISA试剂盒说明书,对BMSCs上清液中VEGF、或大鼠心肌中的VEGF水平进行评估。6、免疫印迹分析测定在4℃下用含有1%PMSF的RIPA裂解BMSCs和心肌组织。首先测定蛋白浓度,之后SDG-PAGE电泳中加入提取的蛋白样品,然后转印至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭后,对应的膜分别与一抗VEGF-A抗体、HIF-1α抗体、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3抗体、在4℃孵育1夜。孵育一抗后的PVDF膜用二抗羊抗兔IgG-HRP在37℃孵育45分钟,用BeyoECL Plus底物发光。用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer）分析条带的密度。7、动物实验200g220g健康雄性Wistar大鼠购自辽宁长生生物技术有限公司。随机分为4组（每组12只）:Sham组、心梗组、心梗+BMSCs组、心梗+BMSCs+梓醇组。移植组在心肌梗死周围区域注射BMSCs（加上或不加49μg/ml梓醇预处理24小时）细胞,心梗组注射相等量的培养基。造模4周后,将大鼠安乐死,取心肌组织,用于后续实验的检测。8、移植后的BMSCs活性检测为了检测BMSCs在体内的活性,移植细胞前,按照试剂盒步骤PKH26细胞标记。收集到的心脏组织在移植后4周切成5μm薄片,细胞核予以DAPI染色。然后用荧光显微镜检测存活的红色荧光的BMSCs。9、心脏超声心动图移植BMSCs4周后,处死大鼠前,麻醉下超声检测心脏功能:包括左室收缩末期内径（LVESD）,左室舒张末期内径（LVEDD）,计算左室射血分数（LVEF）,左室缩短率（LVFS）。10、组织学检查心肌组织切片进行常规的HE和Masson染色,以评估病理改变和心肌纤维化。于光学显微镜下观察染色效果。11、TUNEL为了评估心脏组织的凋亡,我们使用TUNEL法检测细胞凋亡检测试剂盒的步骤进行TUNEL染色。凋亡细胞的细胞核被绿色荧光染色。12、免疫荧光染色按照试剂盒步骤,用免疫荧光染色法检测心脏组织中CD31和Myosin的表达。用DAPI染细胞核后,在荧光显微镜下观察。13、统计学分析:统计分析用GraphPad Prism 5软件处理。采用one-way ANOVA比较总体和组间差异。数据以平均数±标准差表示。P值小于0.05视为有统计学差异。结果:1、BMSCs的鉴定流式细胞术检测BMSCs表面标志物的表达。CD44和CD90阳性的百分比分别为92.1%和75.7%,CD34和CD45阳性细胞分别为1.7%和2.3%,说明成功分离出BMSCs。2、梓醇对氧糖剥夺的BMSCs体外VEGF分泌的影响ELISA检测BMSCs分泌VEGF的情况。氧糖剥夺处理后BMSCs培养液上清中VEGF水平略有升高,但无统计学差异。在氧糖剥夺条件下,梓醇预处理可剂量依赖性地增强BMSCs分泌VEGF。此外,免疫印迹分析评估BMSCs的VEGF-A和HIF-1α蛋白质表达。BMSCs在氧糖剥夺处理后VEGF-A的水平、核的HIF-1α和总HIF-1α上升,梓醇预处理后则显著上调。3、梓醇对氧糖剥夺的BMSCs体外存活和凋亡的影响为了评估梓醇对氧糖剥夺的BMSCs的存活的影响,我们进行了CCK-8检测。氧糖剥夺处理后的BMSCs存活能力明显下降,而梓醇预处理可以有效改善这一点。而且,梓醇对氧糖剥夺的BMSCs的凋亡有明显的抑制作用。为了进一步评价梓醇调控BMSCs的机制,我们采用Western Blot检测对凋亡相关蛋白的表达进行了评估。结果在氧糖剥夺条件下,BMSCs促进抗凋亡蛋白Bcl-2水平下调,促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3水平上调,而梓醇预处理可以显著逆转上述变化。4、梓醇对BMSCs体内移植后存活的影响移植到心脏组织中的存活的BMSCs被标记为PKH26,一种红色荧光染料。结果显示,梓醇预处理明显改善了BMSCs移植后的存活。5、梓醇对BMSCs移植治疗心肌梗死大鼠的疗效HE和Masson染色显示,病理改变和心肌纤维化在心梗组中变化明显。BMSCs移植能有效地减轻心肌梗死所致的病理改变和心肌纤维化,而梓醇预处理可增强BMSCs移植的作用。进一步实验TUNEL和Myosin染色结果表明,心肌梗死导致心梗边界区心肌细胞凋亡增加。然而,BMSCs移植抑制了心肌梗死所致的细胞凋亡,而当使用梓醇预处理BMSCs时,这种抑制作用更为明显。超声心动图检查心脏功能显示,心梗组LVEF、LVFS明显降低。而BMSCs移植可改善LVEF和LVFS,而采用梓醇对BMSCs进行预处理可进一步增强LVEF和LVFS。此外,BMSCs移植抑制了心肌梗死后LVESD和LVEDD的升高。如预期的那样,梓醇预处理BMSCs可以进一步降低LVESD和LVEDD。这些结果表明,梓醇预处理进一步提高了BMSCs在心肌梗死中的疗效。6、梓醇预处理的BMSCs移植心肌梗死大鼠对VEGF分泌的影响CD31在BMSCs移植的缺血心肌细胞中表达明显增强,梓醇预处理后表达更加强。通过Western Blot检测心肌组织中VEGF-A表达,梓醇预处理促进了心肌组织BMSCs移植后VEGF-A的水平。ELISA的结果进一步证明了移植梓醇预处理的BMSCs可以提高VEGF水平。结论:我们的实验表明,梓醇预处理可显著促进BMSCs的存活,增加VEGF的分泌,从而加强心肌梗死大鼠的移植疗效。