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禽网状内皮组织增生症病毒(REV)属于反转录病毒科禽类C反转录病毒。REV主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的一组综合征,包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。反转录病毒作为外源基因表达及传递载体已有大量研究报道,而REV能否作为外源基因表达载体鲜有报道。本研究首先在REV病毒基因组Env基因的N端插入绿色荧光蛋白基因EGFP,构建并拯救出表达EGFP的REV病毒的基础上,将H9流感病毒HA上部分抗原表位插入Env基因的N端,拯救出表达HA抗原表位蛋白的REV病毒,并进行相关病毒特性研究。1、表达绿色荧光蛋白的REV病毒的构建与拯救为尝试REV能否作为病毒载体表达外源基因,并探究外源基因插入位点,本研究利用重组酶ExnaseTMⅡ克隆技术以及反向遗传操作技术,首先将外源基因EGFP插入REV病毒基因组Env基因N端构建外源基因与Env蛋白融合表达的REV传染性克隆,命名为rREV-EGFP-Env。将rREV-EGFP-Env传染性克隆转染DF1细胞进行了病毒拯救,并通过荧光证明获得了表达EGFP-Env的重组REV病毒。研究结果表明,REV基因组Env基因N端能作为外源基因插入位点用来进行外源基因与Env蛋白的融合表达。这为进一步开发REV作为病毒疫苗载体表达外源基因提供了可能。同时,能够表达EGFP-Env的重组REV病毒的获得可以准确有效的跟踪REV病毒的复制,为研究REV的致病机理和组织嗜性提供有力工具和生物材料。2、表达H9流感病毒HA抗原表位蛋白的REV病毒拯救及其特性为了进一步探究REV作为病毒疫苗载体表达外源基因的可能性,将H9流感病毒HA部分抗原表位插入REV病毒基因组Env基因N端,成功构建HA抗原表位与Env蛋白融合表达的REV传染性克隆,命名为rREV-HAep-Env。将rREV-HAep-Env转染DF1进行了病毒拯救,并通过PCR、IFA和Western blot分析证明获得了表达HAep-Env的重组REV,命名为REV-HA。体外生长曲线测定表明,REV-HA在DF1细胞上的生长特性与REV野毒类似。鸡感染性试验发现,在感染七周内REV组和REV-HA组的鸡体重变化情况类似。抗体检测发现,感染后第二周,REV组和REV-HA组均能产生REV抗体,到第三周抗体水平达到高峰。在感染后第七周,进行了 H9流感病毒的攻毒试验。棉拭排毒测定发现,在感染后第二天,REV-HA组的排毒量明显低于REV组和PBS组。这些结果表明,融合表达H9流感病毒HA抗原表位的REV-HA具有与REV野毒类似生物学特性,同时提示REV作为病毒疫苗载体表达外源基因的可行性。