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酸性矿山废水(acid mine drainage，AMD)和酸化尾矿是极端酸性环境(pH<3)的典型代表。由于AMD微生物在环境基因组研究、矿业环境酸化机理及控制等方面具有重要的理论与现实意义，因此有关AMD环境中微生物群落组成及系统发育多样性的研究已经成为当前重要的研究热点。然而，最近分子研究表明，目前科学界对AMD微生物的认识仍然十分有限，而且许多有关嗜酸微生物功能群对产酸贡献的认识是片面甚至是错误的。特别地，在众多AMD产生的重要源头当中，尾矿的研究长期受到忽视，已有的认识主要来自基于培养方法的研究。有鉴于此，本论文采用传统微生物培养与16S rRNA基因(rDNA)克隆文库相结合的方法系统地研究了广东乐昌铅锌尾矿AMD、尾矿以及云浮硫铁矿露天采矿场AMD三个极端酸性环境中微生物群落的组成及多样性，目的是了解这几个典型AMD环境中微生物的多样性，并探讨对AMD产生起主要贡献的微生物功能群的组成。主要研究内容及结果概括如下：
(1)乐昌尾矿AMD(pH 2.0)微生物传统培养结果表明，可培养的嗜酸微生物为氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)和嗜酸异养菌—Acidiphilium cryptum。然而，用16S rRNA方法却揭示尾矿AMD捌有许多在系统发育上不同的微生物。文库中检测到7个细菌类群(目前在AMD中被发现的细菌类群总共有8个)，它们是Nitrospira、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Firmieutes和Acidobacteria。在141个被分析的克隆子中，有104个(占整个文库的73.8％)在系统发育上归入到Leptospirillum属类群Ⅲ(为新发现的具有铁离子氧化能力的微生物类群)；30个在系统发育上属于Proteobacteria，其中一半的克隆子(15个)与具有铁离子还原能力的Alphaproteobacteria成员表现十分相近的系统发育关系，其它的克隆子在系统关系上分布在Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria(各6个克隆子)和具有硫酸根和铁还原能力的Deltaproteobacteria(3个克隆子)细菌类群内；最后的4个克隆子分布在Firmicutes和Acidobacteria两个类群，克隆子数分别为3和1个。文库中大约一半的序列型(代表大部分的16S rDNA克隆子)归入到目前仅有少数纯培养或根本没有纯培养而仅有环境序列的细菌类群内。此外，文库中发现一个新的序列型(LCAll6)。 (2)考虑到尾矿AMD中具有如此特殊的微生物群落(类群Ⅲ占优势)组成，我们进一步对AMD产生的源头一酸化尾矿(pH 1.9)中微生物的多样性进行了研究，以期对这两个酸化环境中微生物的组成及结构进行比较。LIBSHUFF统计分析结果表明，尾矿与尾矿AMD之间微生物群落组成及多样性存在明显差异。尾矿中可培养的微生物包括At.ferrooxidans、Leptospirillum.ferriphilum和Suljobacillus montserratensis等自养铁氧化细菌以及Acidiphilium cryptum嗜酸异养菌。16S rRNA克隆文库分析结果表明，该环境微生物多样性较低，在分析的142个克隆子中，绝大部分(135个克隆子)在系统发育上归入到古细菌Thermoplasmales目，其中128个克隆子(占整个文库的90％)与Ferroplasma．acidiphilum 16S rRNA基因序列的相似性达98.4-199.7％；4个克隆子也归为Ferroplasma属，它们在系统发育树上最靠近的序列为不可培养的古细菌克隆子(ant h4，在西班牙Tinto River中被检测到)，序列相似性为96.9％；其余3个古细菌克隆子在发育树上分别位于Cplasma和Dplasma两个分枝。分子方法也检测到L.ferriphilum的存在。
(3)此外，我们还对云浮硫铁矿露天采矿场AMD(pH 2.6-2.9)中微生物群落组成、结构及多样性进行了系统地研究。采用木端限制性片段长度多态型分析方法(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)对不同季节和空间的七个AMD样品(大塘AMD春夏秋冬的样品分别用S4SPR、S4SUM、S4AUT和S4WIN表示；夏季大塘AMD四个不同位点的样品分别用S1SUM、S2SUM、S3SUM和S4SUM表示)的群落结构进行了研究。结果表明，七个样品(荧光标记的PCR产物)经过内切酶HaelII酶切后，经测序仪检测出来的限制性片段(T-RFs)在大小和数量上表现出明显差异。主成分(PCA)和聚类分析将它们分成三个不同的组：第一组为S4SPR，第二组为S1SUM，第三组为S2SUM、S3SUM、S4SUM、S4AUT和S4WIN。在上述分析结果的基础上，我们对3个具有明显微生物结构差异的样品(S4SPR、S4SUM和S1SUM)进行了深入地系统发育多样性分析。同样地，LIBSHUFF分析表明，构建的三个克隆文库极不相似(P＜0.05)。在S4SPR文库中，共检测到20个序列型，其中一半的序列型在系统发育上分布在Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Nitrospira和Archaea四个类群，它们代表的克隆子占整个文库的80％以上(分别为27.2％、20.8％、8.8％和26.4％)。这些序列型与其它AMD环境中的克隆子(Tui3-12、BA71、AS6)及铁氧化细菌(L ferrodiazotrophum UBAl)、铁氧化古细菌(Ferroplasma acidiphilum)在系统关系上十分相近。此外还检测到一些真核生物的序列(序列型为S4SPR-52)。在S4SUM文库中，共检测到19个序列型，其中14个在系统发育上归入Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria和Deltaproteobacteria三个类群。文库中相对丰度最高的类群为Gamma-proteobacteria，该类群的微生物占到整个文库的50％，与氧化亚铁硫杆菌(At．ferrooxidans)具有十分相近的系统发育关系；其它的序列型主要与克隆子Tui3-12(属于Betaproteobacteria)和AS6(属于Deltaproteobacteria)表现出较高的序列相似性。与前两个文库不同，S1SUM文库中数量上占优势的微生物类群为Betaproteobacteria。尽管检测到的17个序列型中只有3个在系统发育关系上属于此类群，但是它们代表的克隆子可以占到整个文库的65.7％，主要与克隆子Tui3-12在系统关系上最为接近。接下来丰度较高的类群依次为Deltaproteobacteria、Nitrospira、候选门(包括TM7和WS6)和Archaea。上述三个AMD文库中还检测到8个新的序列型，它们分别是S4SPR-111、S4SUM-20、S4SUM-44、S4SUM-130、S4SUM-140、S1SUM-16、S1SUM-19和S1SUM-105。由于这些序列型与已获得的纯培养或环境序列系统关系较远，它们可能代表新的物种。
本论文研究结果表明，三个典型AMD环境中微生物群落组成及多样性明显不同。由于在每个文库中均检测到大量与铁离子氧化有关的微生物存在，这些微生物对AMD的产生有直接的贡献。Leptospirillum属类群Ⅲ所代表的微生物以及Fp.acidiphilum和L.ferriphilum可能是导致乐昌尾矿AMD产生的关键微生物类群；而At.ferrooxidans、Fp.acidiphilum则可能对云浮硫铁矿中FeS<,2>的氧化和AMD的产生起最主要的贡献。本研究进一步拓展了AMD、以及极端酸性尾矿环境中微生物多样性的认识。相关的研究成果对于AMD(或酸化)的控制具有一定的理论和现实意义。