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吡嘧磺降属于磺酰脲类除草剂,具有高效、广谱和高选择性等特点,在我国它广泛运用于稻田一年生、多年生阔叶杂草和莎草科杂草的防控,但是由于其残留期较长,若施用时期不对或用药量过大,极少量的残留就会对后茬敏感作物造成药害,甚至导致作物绝收,而且还可能对非靶标生物造成危害或对土壤环境造成污染。因此,研究解决吡嘧磺隆残留危害问题,减少其对后茬作物药害及土壤环境造成的污染具有重要的理论和现实意义。目前关于吡嘧磺隆的生物降解还鲜见报道,分离筛选能高效降解吡嘧磺隆的微生物菌株并研究其对吡嘧磺隆的降解特性,可为生产上利用该高效菌株实现对吡嘧磺隆在土壤中残留的原位生物修复提供理论依据。本研究对有效控制农田农药污染,保障农产品安全生产均具有重要的意义。具体研究结果如下:
1、从长期被吡嘧磺隆除草剂污染的不同生境中采集的样品中分离得到9株吡嘧磺隆降解效率较高的微生物,对其中一株降解效率最好的编号为S8-1的吡嘧磺隆降解菌株进行了进一步的研究。经过菌落及菌体形态观察、生理生化特性分析、繁殖方式、鞭毛类型、培养特征、活细胞吸收光谱特征、光合作用内膜系统类型等传统微生物鉴定方法,初步鉴定该菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)。菌株S8-1热致死温度及热致死时间试验发现,菌株S8-1在50℃恒温水浴处理一个小时仍然具有活性,随着处理时间的增长,菌株的活性降低甚至菌体死亡。抗生素敏感性试验表明,菌株S8-1对氨苄青霉素的抗性较好,高达100mg/L,而对卡那霉素的抗性浓度为75 mg/L,当在培养基中同时加入氨苄青霉素和卡那霉素时,菌株则没有表现出抗性。
2、利用16SrDNA的序列分析了菌株S8-1系统发育进化分类地位。结果表明:目标菌株S8-1的16SrDNA序列为1424bp,其在GenBank中的登录号为:GQ180069。从构建的系统进化发育树中可以看出,S8-1与Rhodopseudomonas属的其他菌株同为一个小的分支,聚合在一起的可信度为99%,可初步确定S8-1归类于Rhodopseudomonas属细菌。并且还对来自不同生境中分离的其他的光合细菌,进行了系统发育进化关系分析发现,不同生境中分离的光合细菌进化关系具有相对的地理位置的相对保守性及差异性,这也说明微生物具有种群水平的生物多样性和遗传多样性。
3、菌株S8-1的生长条件研究表明,菌株的最适温度为30℃、pH为7.0、光照强度7500lx:随着吡嘧磺隆浓度的升高,菌株生长变缓。优化了吡嘧磺隆残留检测体系,在优化后的检测体系下,吡嘧磺隆的除草剂在5mg/L~20mg/L添加浓度范围内的平均回收率在87.3%~97.5%之间,相对标准偏差(RSD)在2.6%~7.0%之间,可确保试验的可靠性。对菌株S8-1降解特性的研究表明,菌株S8-1在30℃与pH7.0的光合细菌培养基中培养7天,对100mg/L的吡嘧磺隆降解率为52.07%,农药浓度在低于600mg/L时对降解率的影响较小,而浓度达到800mg/L时,降解率出现显著的降低,说明菌株S8-1对吡嘧磺隆的降解受浓度的影响很大。菌株S8-1以共代谢的方式降解吡嘧磺隆除草剂,降解酶的定域实验表明,菌株S8-1降解酶属于胞内酶。
4、从菌株S8-1基因组中克隆到了抗磺酰脲类除草剂ALS基因大小亚基,大亚基1737 bp,编码578个氨基酸;小亚基为492bp,编码163个氨基酸。通过对菌株S8-1大小亚基的氨基酸序列比较分析,我们发现该小亚基氨基酸序列非常保守,没有发现突变位点:而大亚基氨基酸序列两端保守,中间序列多变。因此,推测ALS大亚基氨基酸残基的改变导致ALS的空间结构的变化可能是导致菌株S8-1ALS对ALS抑制剂类除草剂抗性强度差异的原因。
本研究为磺酰脲类除草剂的微生物降解菌资源的挖掘和利用提供了科学依据,为利用光合细菌进行农药残留的生物修复,以及为乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性基因的利用提供了重要的理论参考。