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第一部分吡非尼酮的大鼠药物动力学研究
第一节吡非尼酮大鼠血浆样品测定方法的建立
建立测定大鼠血浆中毗非尼酮浓度的高效液相色谱法。100μ1血浆中加入2％的冰醋酸(HAC)50μl，混匀后加入醋酸乙酯1.5ml，4000r/min离心5分钟，吸取有机层50℃水浴中吹干，用300μl流动相复溶后进样30μl进行分析。色谱柱为ZORBAXC18(4.6×150mm，粒径5μm；AgilentCo)，预柱为KromasilC18；柱温：20℃；流动相为水：乙腈：TFA：三乙胺=75：25：0.1：0.12；流速：1ml/min，紫外检测波长为314nm。以受试品峰面积定量。在此条件下，吡非尼酮在大鼠的血浆浓度在0.2～4mg·L-1和4～100mg·L-1有良好的线性关系，绝对回收率为70.02％～86.55％，相对回收率为95％～104％，日内、日间RSD均小于8％，最低检测浓度为0.2mg·L-1。本方法灵敏、准确且有较高的回收率。
第二节吡非尼酮的大鼠药物动力学研究
SD大鼠25只，雌雄兼有，随即分为5个剂量组(4个灌胃剂量组，1个静注剂量组)经口灌胃(ig.)组，给予PF，剂量分别为25mg/kg，50mg/kg，100mg/kg，450mg/kg，给药容量为1ml/100g；静脉注射(iv.)给药组，按PF溶液50mg/kg的剂量经尾静脉给予，给药容量为0.5ml/100g，用高效液相色谱法测定血浆药物浓度。分别计算4个灌胃剂量组和1个静注剂量组的药物动力学参数。结果表明4个灌胃组的主要药代动力学参数由低到高分别为AUC0-300min：535.00±143.23mg·min·L-1，880.66±315.26mg·min·L-1，2842.25±870.97mg·min·L-1，16200.44±3304.68mg·min·L-1；Cmax：6.24±2.71mg·L-1，8.56±2.31mg·L-1，23.06±8.03mg·L-1，85.67±12.01mg·L-1；Tmax：21.00±8.22min、17±7.58min、27.00±6.71min和48.00±16.43min；Vd：3.74±1.09L、3.28±2.51L、3.04±1.22L、5.02±3.06L；CL：0.05±0.02L/min、0.04±0.03L/min、0.03±0.01L/min、0.01±0.01L/min；t1/2：60.61±23.66min、58.89±28.17min、73.71±31.13min和543.68±828.54min。静注组的主要药物动力学参数为AUC0-300min：1706.86±494.50mg·min·L-1；Cmax：45.10±15.34mg·L-1；t1/2a：6.83±3.66min；t1/2β：109.20±98.46min；Vd：3.47±1.51L；CL：0.03±0.01L/min。结果表明，PF在剂量范围为25mg/kg至100mg/kg时，Cmax、AUC与剂量增加呈线性关系，当剂量为450mg/kg时，剂量增加18倍，AUC增加近30倍，呈非线性药物动力学特征，提示PF在高剂量给药时，药酶代谢呈饱和状。
第三节吡非尼酮的血浆蛋白结合率的研究
本实验采用平衡透析法来研究毗非尼酮血浆蛋白结合率的情况，并将人和大鼠的血浆蛋白结合率进行比较。用高效液相色谱法测定平衡透析膜两侧的PF药物浓度，透析膜一侧为空白血浆，另外一侧为含PF2mg/L、20mg/L、100mg/L药物浓度的NaH2PO4缓冲液，平衡时间为24小时。在2mg/L～100mg/L浓度范围内，PF人血浆蛋白结合率为66.19％-77.78％，PF大鼠血浆蛋白结合率64.09％-84.92％，可见大鼠在PF中剂量血浆蛋白结合率(84.92±0.59μg/ml)和高剂量下的血浆蛋白结合率(84.27±1.07μg/ml)大于人的血浆蛋白结合率(71.67±0.99μg/ml，66.19±2.16μg/m1)。
第二部分吡非尼酮对大鼠肝细胞色素P450酶活性的影响
第一节吡非尼酮对大鼠P450酶总酶活性的影响
采用差示光谱法测定微粒体混悬液蛋白中的P450含量。SD大鼠48只，随机分成空白组、肝药酶诱导剂组、肝药酶抑制剂组，吡非尼酮低剂量组、吡非尼酮中剂量组和吡非尼酮高剂量组。空白组给予1％CMC-Na，诱导剂组地塞米松100mg/kg，抑制剂组酮康唑40mg/kg，PF低、中、高剂量组分别为PF25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg灌胃给药，一日一次，连续6日。取大鼠的肝脏制备肝微粒体，测定肝微粒体中的蛋白浓度，用分光光度计对样品进行比色。结果表明，该药在中剂量组(50mg/kg)和高剂量组(100mg/kg)的P450含量与空白组比较有显著性差异(P＜0.01)，提示该药在较大剂量时对药酶有诱导作用。
第二节吡非尼酮对肝药物代谢酶亚家族CYP3A及CYP2E1的影响作用
采用Nash-甲醛形成法(Nash比色法)来研究吡非尼酮对大鼠CYP3A及CYP2E的影响，配制0.5ml反应液，加入NADPH生成系统启动反应，37℃水浴20min后，加入20％ZnSO40.05ml终止反应，混匀后每管再加入饱和Ba(0H)20.05ml，2500g离心15～20min，将0.35ml上清液转移至另一试管中，加入0.15mlNash试剂，混匀后加入50℃水浴温孵30min，冷却后在412nm测定样品光密度值。结果表明，在给药6d和12d后，吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶(反映CYP2E1)的活性影响不显著(P＞0.05)；而吡非尼酮对大鼠肝微粒体ERD酶(反映CYP3A)具有显著的诱导作用(P＜0.01)并有明显的时间依赖性。