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目的:炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)的发病机制尚不明确,目前研究认为可能与感染、环境、遗传、免疫等因素有关。目前临床上治疗IBD的主要药物有:氨基水杨酸制剂,糖皮质激素,免疫抑制剂,生物制剂等。肠道免疫系统在IBD的发生、发展、治疗中均发挥重要作用。肠道免疫系统分为先天性免疫系统和获得性免疫系统。肠道先天性免疫系统主要包括肠黏膜屏障、先天性免疫细胞及其分泌的细胞因子等,先天性免疫系统异常与IBD的发病有关。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)可表达于肠道多种细胞上,主要介导微生物和细胞间的相互作用,在肠道固有免疫和获得性免疫中均起到重要作用。其中TLR2主要识别革兰氏阳性菌的肽聚糖、分枝杆菌和疏密螺旋体的脂蛋白、酵母菌和支原体的某些成分等。TLR2及其信号通路在IBD疾病中处于高表达状态,抑制TLR2信号通路后可以减轻DSS诱导的小鼠结肠炎。髓样分化因子88(myeloid differential factor 88,My D88)是TLRs信号通路重要的接头蛋白,介导除TLR3以外的TLRs家族信号通路。细胞膜表面的TLR与配体结合后,引起胞内段TLR与My D88接头,引起IRAK1磷酸化,诱导IκB磷酸化,最终激活核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB),调控靶基因的转录,引起炎症因子释放。NF-κB是多种信号通路的汇聚点,与炎症、肿瘤、感染、自身免疫性疾病等密切相关。肠道获得性免疫系统中T细胞扮演者重要的角色,主要包括辅助性T细胞(T helper cell,Th),调节性T细胞(regulatory T cell,Treg),细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells,Tc)等。既往的研究认为CD和UC的发生分别是以Th1及Th2细胞介导的免疫反应有关。Th17细胞主要分泌白细胞介素(interleukin,IL)17、IL21、IL22等细胞因子,IL17是其主要的效应因子,它可诱导促炎因子IL6、TNF-α,趋化因子KC、MCP-1、MIP-2及MMPs的生成,通过联合获得性免疫与先天性免疫的方式促进炎症的发生。转录因子视黄酸受体相关孤核受体γt(retineic acid receptor related orphan nuclear receptor gamma t,RORγt)在原始T细胞分化为Th17的过程中起到关键作用。研究发现,干扰TLRs信号通路后,影响原始T细胞分化的相关因子随之受到影响,进而影响原始T细胞分化。益生菌作为于人体有益的活性微生物制剂,越来越多的应用于IBD的治疗中,可能的作用机制主要为调节肠道菌群、改善肠黏膜屏障功能、调节肠道免疫功能等。有研究显示双歧杆菌等益生菌可以促进Treg细胞的分化,抑制Th1、Th2等细胞的分化。酪酸梭菌(Clostridium butyricum,C.butyricum)作为一种革兰氏阳性杆菌,有研究显示酪酸梭菌代谢产物可影响TLRs的表达,由此可见酪酸梭菌与TLRs之间存在着密切的关系。本研究拟通过DSS诱导的小鼠实验性结肠炎模型,在动物体内探讨酪酸梭菌对结肠炎小鼠的保护作用,观察其对TLR2、TLR2/My D88/NF-κB信号通路以及对Th17细胞分化、功能的影响,进一步探讨酪酸梭菌治疗IBD可能的免疫调节机制。拟在细胞实验层面探讨酪酸梭菌对TLR2/My D88/NF-κB信号通路的作用机制及其干扰Th17细胞可能的免疫机制。通过上述研究,深入探讨酪酸梭菌对IBD的免疫调节机制,为治疗IBD提供更多的理论依据,为IBD的治疗提供潜在的治疗靶点。研究方法:1.8周龄BALB/c小鼠,随机分成5组。Control组:自由饮水,0.4ml双蒸水每日灌胃1次;DSS组:5%DSS自由饮用,0.4ml双蒸水每日灌胃1次;DSS+C.butyricum(1x109CFU)组:5%DSS自由饮用,0.4ml酪酸梭菌1x109CFU每日灌胃1次;DSS+C.butyricum(1x108CFU)组:5%DSS自由饮用,0.4ml酪酸梭菌1x108CFU每日灌胃1次;DSS+C.butyricum(1x107CFU)组:5%DSS自由饮用,0.4ml酪酸梭菌1x107CFU每日灌胃1次;上述操作连续7天。应用流式细胞术检测小鼠外周血CD3+CD4+IL17A+T(Th17)细胞表达情况。记录结肠长度,进行DAI评分及病理组织学评分,应用免疫组织化学法、western blot法、quantitative real-time PCR(q RT-PCR)法检测各组小鼠结肠组织中TLR2、IL17、IL23、RORγt的表达。2.8周龄BALB/c小鼠,随机分成5组。Control组:自由饮水,0.4ml双蒸水每日灌胃1次;DSS组:5%DSS自由饮用,0.4ml双蒸水每日灌胃1次;DSS+C.butyricum组:5%DSS自由饮用,0.4ml酪酸梭菌1x109CFU每日灌胃1次;DSS+C.butyricum+anti-TLR2组:5%DSS自由饮用,0.4ml酪酸梭菌1x109CFU每日灌胃1次,第1、3、5、7天CD282 10ug腹腔注射1次;DSS+anti-TLR2组:5%DSS自由饮用,0.4ml双蒸水每日灌胃1次,第1、3、5、7天CD282 10ug腹腔注射1次;上述操作连续7天。第8天应用流式细胞术检测小鼠外周血Th17表达情况。进行DAI评分及病理组织学评分,应用western blot法、q RT-PCR法检测各组小鼠结肠组织中TLR2、My D88、NF-κBp65、IL17、IL23、RORγt的表达。3.酪酸梭菌上清液作用于结肠细胞HCT-116,应用TLR2阻断剂(CD282)和TLR2激动剂(Pam3CSK4)干扰TLR2信号通路,观察酪酸梭菌上清液对TLR2、My D88、NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65以及RORγt表达的影响。结果:1.体重:DSS组最低,酪酸梭菌组均高于DSS组(P<0.05)。DAI评分:DSS组从第4天开始升高,第7天达高峰,酪酸梭菌干预组均低于DSS组,DSS+C.butyricum(1×109 CFU)组最低,(P<0.05)。结肠长度:除Control组外其余4组均缩短,DSS组缩短最明显,酪酸梭菌干预组均有所改善,(P<0.05);但酪酸梭菌不同浓度间比较(P>0.05)。HE染色见DSS组病变主要累及粘膜层及粘膜下层,重者可累及至浆膜层,可见溃疡、出血、肉芽组织、隐窝炎及隐窝脓肿形成。病理组织学评分:DSS组最高,酪酸梭菌干预组均有所下降,DSS+C.butyricum(1×109CFU)组最低,(P<0.05)。各组小鼠外周血中Th17细胞比例,Control组最低,DSS组最高,酪酸梭菌干预组有所下降,DSS+C.butyricum(1×109 CFU)组低于其他酪酸梭菌组,(P<0.05)。RORγt表达于肠固有层淋巴细胞,细胞核染色;IL17和IL23表达于结肠细胞,细胞膜和细胞浆染色;TLR2呈细胞膜及细胞浆染色,肠上皮细胞、隐窝上皮细胞、固有层淋巴细胞均有表达。TLR2、IL17、IL23、RORγt的m RNA和蛋白的表达情况趋势相同:Control组最低,DSS组表达量最高,酪酸梭菌干预组均有所下降且DSS+C.butyricum(1×109 CFU)组抑制作用最强,(P<0.05)。TLR2的变化与IL17、IL23、RORγt的变化均存在正相关关系。2.DSS+C.butyricum+anti-TLR2组DAI评分及病理组织学评分明显低于DSS组,略高于DSS+C.butyricum组,(P<0.05)。DSS组TLR2表达最高,DSS+C.butyricum组有所下降,DSS+anti-TLR2组TLR2表达水平低于DSS组,上述差异均(P<0.05)。小鼠外周血中Control组Th17细胞表达量最低,DSS组最高,应用酪酸梭菌后有所下降;DSS+anti-TLR2组低于DSS组;DSS+C.butyricum+anti-TLR2组高于DSS+C.butyricum组,仍明显低于DSS组;上述差异均(P<0.05)。DSS组My D88、NF-κBp65、RORγt的表达均高于Control组;加入酪酸梭菌后,上述指标表达下降;DSS+anti-TLR2组上述指标表达低于DSS组;上述差异均(P<0.05)。DSS+C.butyricum+anti-TLR2组上述指标表达水平略高于DSS+C.butyricum组,仍明显低于DSS组;上述差异均(P<0.05)。3.酪酸梭菌上清液可抑制HCT-116细胞TLR2、My D88、RORγt、NF-κBp65的m RNA和蛋白的表达、抑制磷酸化NF-κBp65蛋白的表达;CD282部分阻断TLR2后,酪酸梭菌上清液对上述指标仍有抑制作用但被削弱了;Pam3CSK4激活TLR2后,酪酸梭菌上清液仍可以明显抑制上述指标的表达;上述结果差异均(P<0.05)。结论:1.酪酸梭菌可以改善DSS诱导的小鼠急性肠道炎症,改善其DAI评分及病理学评分,且有浓度依赖性。酪酸梭菌可抑制TLR2的表达,下调小鼠外周血Th17细胞比例,下调IL17、IL23及RORγt的表达水平,对DSS诱导的小鼠急性肠道炎症具有一定的保护作用。2.酪酸梭菌可抑制RORγt及IL23的表达,进而抑制Th17的表达并影响其分泌IL17的功能,从而减轻DSS诱导的小鼠实验性结肠炎,上述作用有一部分是通过其抑制TLR2/MyD88/NF-κB信号通路而实现的。3.酪酸梭菌上清液可抑制TLR2/My D88/NF-κB信号通路,可抑制RORγt的表达,上述作用有一部分是通过酪酸梭菌上清液对TLR2的抑制作用而实现的。