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一、目的水通道蛋白(AQPs)是一种很小的、固有的膜蛋白,它能促进水、甘油、尿素等在细胞浆膜上的运输而参与许多生理和病理过程。AQP3在“着床窗口期”的人子宫内膜中高表达,并能促进高接受态子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭,促进胚胎着床的顺利进行,但对AQP3的转录调控机制研究较少。转录因子Sp1为哺乳动物细胞中发现的第一个转录因子,通过调节相关基因表达,介导肿瘤生长和转移。转录因子E2F1主要参与调控细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡和分化相关基因表达。本文通过预测并选定与AQP3启动子结合的转录因子Sp1、E2F1等,并通过染色质免疫共沉淀实验和双荧光素酶报告基因分析转录因子Sp1、E2F1是否可与AQP3启动子结合,干扰和过表达转录因子Sp1、E2F1分析是否影响AQP3表达,探讨AQP3介导子宫内膜癌细胞迁移、侵袭的分子机制。二、方法1、通过生物信息学方法预测与AQP3启动子结合的转录因子,结合文献将转录因子Sp1、E2F1、NF-κB1作为初步研究对象;2、利用脂质体转染法将购买的小干扰RNA(si-NC、si-Sp1、si-E2F1、si-NF-κB1)转染到Hela细胞中,通过实时定量PCR实验初步筛选激活AQP3转录的转录因子;3、利用脂质体转染法将NC+Basic(si-NC+pGL3-basic+pRL-TK)、NC+AQP3-promoter(si-NC+p GL3-AQP3-promoter+p RL-TK)、si-Sp1+AQP3-promoter(si-Sp1+p GL3-AQP3-promoter+p RL-TK)、si-E2F1+AQP3-promoter(si-E2F1+p GL3-AQP3-promoter+p RL-TK)、si-Sp1+Basic(si-Sp1+p GL3-basic+p RL-TK)、si-E2F1+Basic(si-E2F1+p GL3-basic+p RL-TK)转染到Hela细胞中,通过双荧光素酶报告基因实验分析转录因子Sp1、E2F1是否结合到AQP3启动子上;4、通过生物信息学方法预测AQP3启动子上Sp1的结合位点,将S1(-615/+22)构建到pGL3-basic载体上;5、利用脂质体转染法将NC+Basic(si-NC+p GL3-basic+p RL-TK)、si-Sp1+S1(si-Sp1+p GL3-AQP3-S1(-615/+22)+p RL-TK)、Empty vector+S1(Empty vector+p GL3-AQP3-S1(-615/+22)+p RL-TK)、Sp1 vector+S1(Sp1vector+p GL3-AQP3-S1(-615/+22)+p RL-TK)转染到Hela细胞中,通过双荧光素酶报告基因实验,分析转录因子Sp1特异性结合到AQP3启动子上的位置;6、在Hela细胞中,通过染色质免疫共沉淀实验和PCR实验,验证转录因子Sp1特异性结合到AQP3启动子上的位置;7、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,通过Western blot、实时定量PCR及免疫荧光实验,检测转录因子Sp1、E2F1在两种人子宫内膜癌细胞中的表达与分布情况;8、通过脂质体转染法将Sp1过表达质粒、si-Sp1、si-E2F1转染到人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中;9、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,通过Western blot实验,检测不同浓度的Mith A对Sp1蛋白表达的影响;10、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,通过Western blot、实时定量PCR实验,检测转录因子Sp1对AQP3表达的影响;11、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,通过Transwell、细胞划痕实验,检测转录因子Sp1对人子宫内膜癌细胞迁移和侵袭能力的影响;12、在人子宫内膜癌细胞系HEC-1A细胞中,通过Western blot、实时定量PCR检测转录因子E2F1对NF-κB信号通路和AQP3表达的影响。三、结果1、转录因子Sp1特异性结合到AQP3启动子上,激活AQP3的转录,而E2F1、NF-κB1不能结合到AQP3启动子上,激活AQP3的转录;2、转录因子Sp1、E2F1在子宫内膜癌细胞HEC-1A细胞中的表达高于Ishikawa细胞,表达位置都在细胞核;3、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,随着Mith A浓度的增加,Sp1表达逐渐减少;4、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,下调Sp1,减少AQP3的表达,降低细胞的迁移和侵袭能力;5、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,上调Sp1,增加AQP3的表达,促进细胞的迁移和侵袭;6、在子宫内膜癌细胞HEC-1A中,下调E2F1,激活NF-κB信号通路,减少AQP3的表达。四、结论1、转录因子Sp1可以特异性结合到AQP3启动子上,激活AQP3的转录;2、在人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中,转录因子Sp1上调AQP3的表达,从而促进细胞的迁移和侵袭;3、在人子宫内膜癌细胞系HEC-1A细胞中,转录因子E2F1通过减少NF-κB信号通路的激活,增加AQP3的表达。