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猪瘟（Classical swine fever,CSF）是一种严重危害养猪业的传染病,目前的防控措施主要以疫苗注射为主。中国猪瘟兔化弱毒疫苗株（hog cholera lapinized virus,HCLV）是世界公认的金标准弱毒疫苗,为我国乃至世界CSF的防控做出了重大贡献。因CSF活苗免疫猪群与猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）野毒感染产生的抗体无法进行区分,且近几年我国部分CSF活疫苗免疫猪群中有新基因亚型的CSFV出现,为我国CSF的防控提出了新的挑战。为此,了解CSFV的遗传进化关系和研发能够区分感染和免疫动物（Differentiating Infevted from Vaccinted Animals,DIVA）的新型CSF标记疫苗就显得极为重要。为了解CSFV E2基因的遗传进化关系,本研究采集20份疑似CSF病料,运用RT-PCR方法对CSFV E2的部分基因进行扩增并序列测定,获得了3株CSFV分离株,分别将其命名为GDFS1-2017-China、GDFS2-2017-China和GDQY-2018-China,将这3株分离毒株的E2部分基因序列（190 bp）与GenBank中注册的中国CSFV参考毒株进行遗传进化关系分析。结果显示,3株CSFV分离株与CSF疫苗株的核苷酸相似性为78.9%81.6%,与CSF石门株的核苷酸相似性为78.9%82.1%。遗传进化关系分析表明,这3株CSFV都属于基因2群的2.1c亚群。为了进一步探究CSFV毒株的种群演化速率关系,利用贝叶斯马尔科夫链蒙特卡洛方法（the Bayesian Markov Chain Monte Carlo method）对GenBank中注册的不同地域、不同时间的CSFV毒株E2基因进行分析,结果显示,CSFV E2基因（1119 bp）的平均核苷酸替代率为3.1045×10-4个核苷酸/位点/年(95%HPD:3.0×10-4,3.3184×10-4)。CSFV时间进化树结果显示,CSFV毒株的最近共同祖先（The most recent common ancestor,TMRCA）来源于1489年,在15世纪中期和17世纪初期产生两个大的进化分支,同时,从上世纪90年代至今发现的CSFV毒株大都来源于17世纪初期的进化分支。CSFV群体动态分析结果显示,CSFV的暴发总体呈上升趋势,18世纪以前上趋势较为平缓,在18世纪初期和19世纪初期经历过两次快速增长,20世纪末期开始,病毒种群迅速下降。本研究以HCLV基因序列为参考,进行全长基因合成,为了获得一个精准的HCLV基因组RNA,在其全基因组序列的5’-UTR端依次插入CMV增强启动子、内含子、T7启动子、榔头状核酶（Hammer ribozyme,HamRz）序列,3’-UTR端依次插入丁型肝炎核酶（Hepatitis delta virus ribozyme,HdvRz）、T7终止子、SV40 PolyA序列,同时在HCLV E1基因C末端插入标记基因FLAG,构建重组质粒CN5266-1-PSK,建立基于RNA聚合酶Ⅱ的HCLV反向遗传操作系统,该操作系统可直接将以CMV为启动子的全长感染性克隆转染猪源易感细胞进行病毒拯救。将重组质粒CN5266-1-PSK转染SK-6和BHK-21细胞,同时设置空白细胞作为对照组,将转染的细胞盲传3代,每一代均用RT-PCR方法检测病毒RNA和用CSFV E2的单克隆抗体进行IFA检测,结果显示,PCR未扩增出特异性目的条带,且SK-6细胞内未见毒株vC-FLAG的特异性荧光,表明没有拯救出毒株vC-FLAG的病毒粒子。在重组质粒CN5266-1-PSK的基础上,为了成功的构建出标记毒株的感染性克隆,分别从标记病毒本身和细胞内拯救系统两个方面对我们的病毒拯救系统进行了验证。首先,我们从标记病毒本身进行验证,构建重组质粒CN5266-1-mut（cut flag）-SwaI-PSK（疫苗株vC）和CN5266-1-mut-SwaI-PSK（标记株vC-FLAG）,对重组质粒进行体外线性化处理,通过体外转录得到RNA,将得到的mRNA用脂质体转染SK-6细胞,将转染的细胞盲传3代,每一代均用CSFV E2的单克隆抗体进行IFA检测,结果显示,SK-6细胞内未见毒株vC和vC-FLAG的特异性荧光,表明没有拯救出毒株vC和vC-FLAG的病毒粒子。为了验证细胞内反向遗传系统中的主要功能原件CMV启动子、HamRz和HdvRz是否发挥作用,我们又构建了重组质粒CN5266-1-EGFP并转染SK-6细胞后24 h,在荧光显微镜下观察,能明显看到发荧光的细胞,表明CMV启动子在SK-6细胞中发挥了作用。接着构建了重组质粒CN5266-1-EGFP（包含HamRz功能位点）和CN5266-1-EGFP（cut GTC）（去除HamRz功能位点）并转染SK-6细胞后48 h进行Western blot检测。结果显示,CN5266-1-EGFP（cut GTC）中标签EGFP的基因表达量明显高于CN5266-1-EGFP,表明HamRz能够发挥剪切功能。最后在重组质粒CN5266-1-EGFP的基础上构建了重组质粒CN5266-1-EGFP-FLAG和CN5266-1-EGFP-FLAG（cut HdvRz）（去除HdvRz序列）并转染SK-6细胞后48 h进行Western blot检测。结果显示,重组质粒CN5266-1-EGFP-FLAG中确实存在两种形式的EGFP,但是CN5266-1-EGFP-FLAG（cut HdvRz）和CN5266-1-EGFP-FLAG中FLAG基因的表达量却没有明显区别,表明HdvRz能够发挥切割作用,但切割效率不高。综上所述,本研究对CSFV的E2基因进行了遗传进化分析,为从当前流行毒株的筛选出疫苗候选毒株提供理论依据,同时构建了猪瘟弱毒株反向遗传系统,并对反向遗传系统中的不同功能元件进行了验证,为下一步CSF标记疫苗的研发奠定基础。