【摘 要】
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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)是一种具有诸多生理功能的天然脂肪酸,现已被用于食品、保健品。饲料工业等领域,有着较为广阔的应用前景。而亚油酸异构酶(Linole
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共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)是一种具有诸多生理功能的天然脂肪酸,现已被用于食品、保健品。饲料工业等领域,有着较为广阔的应用前景。而亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase, LAI)作为共轭亚油酸生物转化的关键酶有着极为重要的研究意义。目前,微生物发酵生产CLA可以获得单一异构体、生产条件较温和、活性异构体高含量,但是在生产过程中微生物发酵也存在不少问题,如底物抑制菌体生长、微生物培养易污染等。生物酶法生产CLA可以解决底物对菌体生长的抑制等问题,且生产条件温和、生产设备简单、对环境无污染。所以,获得高活性、高纯度、高稳定性的LAI是实现CLA量产的必经之路。本研究从基因工程菌JM109-LAI-pQE30中诱导表达重组LAI,经亲和层析得到纯化的重组LAI；为了提高重组LAI的稳定性,随后采用聚电解质层层自组装技术对LAI进行微囊化,并对微囊化LAI进行酶学性质的研究。结论如下：(1)基因工程菌JM109-LAI-pQE30诱导表达重组LAI的最佳条件：诱导时机为培养菌体7h时进行诱导,诱导培养时间为10h,诱导剂浓度为0.15mmM,诱导培养温度为30℃。最佳诱导表达条件下所得LAI粗酶液酶活力为(3.85±0.075)×103U/mL。通过SDS-PAGE电泳检测可得,LAI的相对分子量为64.7kD。(2)经Ni-NTA树脂纯化,纯化后LAI比活力为2.16×103U/mg、酶活力回收率为87%、纯化倍数23.3倍。经SDS-PAGE电泳检测可见较为单一的条带,纯化成功。(3)利用聚电解质层层自组装技术对LAI进行微囊化,所得结论如下：(a)在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下均可见,模板及制备的微囊化LAI呈球状；(b)制备模板的CaCl2:NaC03:LAI的最佳比例为1：1：2；(c)采用4个PAH/PSS双层膜制备的LAI微胶囊比活力最高可达(2.12±0.085)×103U/mg；(d)微囊化LAI最适反应温度50℃、最适反应pH为5,该酶温度在20~60℃间、pH为2~7间能保持稳定,半衰期为95.4h。
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