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树突状细胞(dendritic cells,DCs)是免疫系统中最主要的抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs),它具有强大的抗原处理和递呈能力。由于其分布广泛,可以第一时间发现并处理外来抗原并将其递呈至T细胞,诱导免疫应答或者免疫耐受。DCs功能介导与其表面大量的免疫分子密切相关。DC-SIGN属于II类C型凝集素,由胞内段、跨膜段和胞外段组成,分子量为44kDa。胞外段只有一个糖基识别序列(carbohydrate recognition domain,CRD),识别一些单糖和寡糖。DC-SIGN主要表达于DCs,是单核细胞来源的DCs(monocyte-derived dendritic cells,Mo-DC)表面重要的标记分子。DCs表面的DC-SIGN与抗原结合后可以介导抗原的内吞,并递呈至T淋巴细胞,诱导免疫应答,而HIV-1的包膜糖蛋白gp120则可以利用DC-SIGN逃避免疫监视,从而有利于HIV-1对T细胞的感染,此外,DC-SIGN还介导DCs的转运并参与调节免疫应答。因此构建DC-SIGN转基因细胞及研制鼠抗人DC-SIGN单克隆抗体不仅在理论研究中具有重要的意义而且在临床应用中具有重要的价值。本论文分为两个部分:1.人DC-SIGN基因克隆及其转基因细胞的构建从人外周血Mo-DC中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法,把总RNA中的mRNA逆转录成cDNA并大量扩增目的基因。将目的基因装入pGEZ-Term载体中并测序,通过脂质体转染技术将测序正确的重组逆转录病毒载体pGEZ-Term/DC-SIGN与两个辅助病毒载体共转染包装细胞293T,用其培养上清感染L929细胞,72h后,用Zeocin筛选并最终获得了稳定表达DC-SIGN分子的L929基因转染细胞。2.鼠抗人DC-SIGN单克隆抗体的研制及其鉴定以DC-SIGN转基因细胞株L929/DC-SIGN为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,经HAT选择培养,以L929/DC-SIGN细胞株作为阳性筛选细胞株,以转pGEZ-Term的L929/mock细胞作为阴性对照细胞株,经免疫荧光标记分析,对抗体分泌阳性孔内细胞的反复筛选并经多次的克隆化培养,最终获得1株持续、稳定分泌鼠抗人DC-SIGN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为4G8。杂交瘤细胞株经体外连续传代(40代)培养,液氮冻存半年后复苏,仍生长良好,稳定分泌抗体。采用本室建立的腹水诱生方法生产单克隆抗体,腹水的产量平均为3.5ml/只小鼠。经Protein G亲和层析柱分离纯化抗体,单克隆抗体纯化后蛋白含量在4mg/ml之上,免疫荧光法分析表明,其效价在1:1000以上,抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为0.2～2μg/1×106细胞。核型分析结果显示,杂交瘤4G8的染色体数目超过小鼠体细胞数目,表明杂交瘤4G8为融合体。经快速定性试纸条鉴定,单克隆抗体4G8的重链为IgG1,轻链为κ链。Western blot及流式细胞分析均显示,单克隆抗体4G8能与DC-SIGN分子特异性结合。竞争抑制实验结果表明,单克隆抗体4G8与商品化抗体E021819识别不同的抗原表位。流式细胞分析显示,DC-SIGN分子特异性高表达于Mo-DC,并且随着Mo-DC的成熟表达水平有一定降低;外周血来源的单核细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞均不表达DC-SIGN分子;人B淋巴瘤细胞株Daudi及Raji、人T淋巴瘤细胞株Jurkat、人白血病细胞株K562、肺癌细胞株A549及H1299、人单核来源的THP-1、U937等肿瘤细胞株也均不表达DC-SIGN分子。流式细胞技术分析DC-SIGN分子在单核来源的肿瘤细胞株THP-1、U937上的诱导表达情况,结果显示,经PMA和IL-4联合刺激后THP-1细胞株上有DC-SIGN分子的表达,并且在刺激48h后达到了较高水平,刺激72h后表达水平又有所降低;而U937细胞株上始终未检测到DC-SIGN分子的表达。证实了THP-1细胞株可以作为单核细胞向DCs分化的模型。