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登革病毒(Denguevirus，DEN)为单股正链RNA病毒，是急性蚊媒传染病一登革热的病原体。目前登革的预防主要依赖于切断蚊媒传播，尚无有效的疫苗用于其预防。新型的表位多肽疫苗是目前研发的DEN疫苗的新方向，它是基于B细胞表位或T细胞表位合成的多肽，既能激活B细胞产生特异性抗体，保护机体免受特异病原的攻击，又能激活CTL(细胞毒性T淋巴细胞CD8+T细胞)清除病毒感染的靶细胞，也能激活CD4+T细胞辅助体液免疫应答。
常规疫苗如亚单位疫苗、嵌合体疫苗等多以E蛋白为其靶位，因为E蛋白是病毒体最大的结构蛋白和主要包膜糖蛋白，构成病毒粒表面的突起。它决定着病毒的组织嗜性，介导病毒与细胞受体的结合，同时它还影响病毒毒力、引起保护性免疫反应和免疫病理损伤。因此我们在本课题中以E蛋白作为研究靶位，以期通过筛选并鉴定E蛋白上潜在的型特异性保护性B细胞和T细胞抗原表位从而为表位多肽疫苗研制提供重要信息。
本文综合利用网络服务器、数据库及生物信息学软件对登革2型病毒国际标准NGC株E蛋白的理化性质、二级结构、穿膜螺旋、结构域、空间结构、柔韧性、表面可及性、亲水性等参数进行生物信息学的分析，可全面了解E蛋白与病毒感染、毒力和免疫相关的结构特征，同时运用新型表位多肽疫苗的研究策略，预测E蛋白B细胞和T细胞抗原表位所在位置，并运用体外免疫学实验加以筛选和鉴定。
一、登革2型病毒E蛋白的生物信息学分析
根据DEN2NGC株E蛋白氨基酸序列(GenBankAccessNumber：BAA00255)，利用在线的网络服务器http://www.expasy.org经Tagldent程序分析登革病毒E蛋白分子量，等电点；经AACompldent程序分析，可得到E蛋白各氨基酸所占比例。运用DNAstar软件包中Protean软件的Chou-Fasman和Gamier-Robson方法分析E蛋白的α螺旋、β折叠、β转角和Coil卷曲所在区段。服务器http://www.cbs.dtu.dk中分别使用TMHMM软件和sigalP2.0软件分别预测E蛋白的穿膜螺旋和信号肽切割位点，可知蛋白在第443～465位氨基酸和第472～494位氨基酸之间有两段穿膜结构而E蛋白并无信号肽切割位点。在免疫信息学网站http://tools.immuneepitope.org中分别采用Karplus&Schulz、Emini及Parker方法分别对柔韧性、表面可及性及亲水性进行分析。通过三种方案的综合运用，发现三种参数所位于的氨基酸区段较多而且较为密集，其中表面可及性和亲水性皆可获得较高的分值。
运用pepwheel程序对E蛋白肽链作螺旋状轮图，识别疏水和亲水的区域，显示序列螺旋的横切面，反应序列的性质。E蛋白的肽轮状图可显示疏水性氨基酸所占比例较大，与E蛋白为包膜蛋白符合。
在Prosite数据库中分析E蛋白的结构域(Domain)和空间结构可知E蛋白由3个Domain组成，其中DomainI所在的氨基酸区段为第1～52，32～191和278～294位氨基酸。DomainII所在的氨基酸区段为第53～131和192～277位氨基酸，而DomainIII所在的氨基酸区段为第294～493位氨基酸。预测所得到的激酶的磷酸化位点是信号转导的重要通路，糖基化位点可能是登革病毒包膜糖蛋白E潜在的修饰位点。E蛋白在成熟的病毒颗粒中被包装并排列成紧密的鲱鱼骨架形态，包含30个类似救生筏状的结构，每个筏状结构由3个平行的二聚体组成。
二、登革2型病毒E蛋白的B、T细胞表位分析和多肽设计
在哈佛大学网站http://mif.dfci.harvard.edu采用Kolaskar&Tongaonkar进行B细胞抗原表位的预测。E蛋白的B细胞抗原趋势最高分值为1.255，位于第481位氨基酸残基亮氨酸(Leu)上。在第25、60、120、140、220、250、320、450和490左右的氨基酸存在几个B细胞抗原趋势值较高的区域。
利用免疫信息学网站http://www.imtech.res.in/提供的软件ProPred-I和ProPred和在哈佛大学网站http://bio.dfci.harvard.edu/RANKPEP/提供的软件Rankpep分别进行HLA-I和HLA-II类分子限制性的T细胞表位进行预测；并从中选择在我国HLA基因分布频率最高的等位基因进行预测。
综合ProPred-I、ProPred和RankpepT细胞表位预测三种软件和用于预测B细胞表位的Kolaskar&Tongaokar方法的结果获得T细胞和B细胞候选抗原表位。
综合B细胞和T细胞表位分析的结果，设计并送广州杰特伟生物有限公司合成，运用Fmoc-butyl固相合成侧链保护策略，在ABI多肽合成仪上合成抗原多肽，HPLC纯化和分析。得到两条登革2型病毒合成肽P1和P2，均为15个氨基酸，具体序列为RHVLGRLITVNPIVTE345～359；EPGQLKLNWFKKGSSE383～397；纯度分别为94.97％；99.17％。同时合成一条登革1型病毒的多肽作为对照(序列为QHGTVLVQVK，E316～325)，纯度为87％。
三、登革2型病毒候选B细胞和T细胞表位多肽免疫学的研究
合成肽的动物学实验：合成肽偶联载体蛋白分别与其相应组的小鼠在免疫前、第2次免疫以及末次免疫后，随机抽取的8只小鼠经间接EIASA法检测在一系列稀释度下的OD450nm值，绘制免疫前、2次免疫后及末次免疫后的曲线变化图。
合成肽的特异性实验：间接ELISA法检测将合成肽分别与已感染登革2型病毒的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行EIASA反应并检测其OD值，统计学处理采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。经单因素方差分析(One-wayANOVA)，合成肽P1、P2分别与已感染登革2型病毒的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行EIASA反应的OD值之间的差异有统计学意义(F=50.807，P=0.000；F=232.050，P=0.000)。
合成肽的血清学实验：间接EIASA法检测合成肽与10份正常人血清及登革病毒感染恢复期患者血清的反应，统计学处理采用SPSS13.0软件进行两样本t检验。经两样本t检验，合成肽P1、P2分别与恢复期患者血清及正常人血清的ELISA结果比较，差异有统计学意义(t=8.374，P=0.000;t=6.504，P=0.000)。
合成肽的ELISPOT实验：建立登革病毒感染小鼠模型后，分离小鼠脾脏淋巴细胞，采用酶联免疫斑点(ELISPOT)实验用IFN-γELISPOT试剂盒检测抗原表位多肽能否刺激机体产生细胞免疫，刺激T淋巴细胞分泌细胞因子如IFN-γ，记数斑点形成细胞即IFN-γ分泌细胞数量，统计学处理采用SPSS13.0软件进行析因设计的方差分析，确定抗原多肽是否为DEN型特异性T细胞表位。IFN-γELISPOT试剂盒检测IFN-γ生成细胞，接种病毒组比正常组产生较多IFN-γ生成细胞，正常组产生细胞为0/1×105个细胞，且接种病毒组中合成肽刺激组IFN-γ生成细胞数目为15～45/1×105个细胞和113～180/4×105个细胞，与无肽刺激组(空白对照)、无关多肽刺激组(阴性对照)和PHA刺激组(阳性对照)相比，差异有统计学意义。因无肽刺激组(空白对照)和无关多肽刺激组(阴性对照)的斑点数量均为0，故比较在两种细胞浓度下，另外两种不同处理PHA刺激组(阳性对照)和实验组(合成肽P1刺激组)的ELISPOT数目的差异。析因分析结果表明，两种不同处理的主效应即合成肽P1刺激组与PHA刺激组间差异有统计学意义(F=9848.818，P=0.000)；两种细胞浓度的主效应有统计学意义(F=1367.717，P=0.000)；不同处理组间和细胞浓度的交互效应有统计学意义(F=17.081，P=0.000)。
以上结果表明，我们的筛选设计并合成的合成肽P1E345～359在表位预测软件中B细胞表位和T细胞表位预测均获得较高分值，经生物信息学分析其可能同时包含B细胞和T细胞表位，同时合成肽P2E383～397也在B细胞表位预测软件中预测为潜在的B细胞表位，而在体外免疫学实验研究中，应用ELISA方法检测的动物学实验、特异性实验和血清学结合实验中两合成肽P1、P2均比对照组具有良好的免疫原性、特异性和结合性，在ELISPOT实验中，合成肽P1也能良好地诱发Th1型细胞免疫并刺激已感染DEN并获得免疫记忆的小鼠脾脏T淋巴细胞分泌较高水平的IFN-γ，与阴性对照、空白对照和阳性对照的差别有统计学意义(P<0.01)。
我们通过综合运用在线的网络服务器、生物信息学软件和数据库对登革2型病毒国际标准NGC株E蛋白进行理化性质、二级结构、穿膜螺旋、结构域、空间结构、柔韧性、表面可及性和亲水性等参数进行生物信息学的分析，并进行B细胞和T细胞抗原表位的预测。经生物信息学综合分析、设计并合成的抗原多肽经体外免疫学实验ELISA和ELISOT验证后，证实了预测的可靠性，并筛选到了一条DEN特异性B细胞表位多肽和一条可能同时包含T细胞表位和B细胞表位的多肽，这为E蛋白的功能学研究、探讨DHF/DSS发病机理和型特异性保护性B细胞和T表位的表位的筛选奠定基础。