基于DNA酶放大比色检测蛋白质和核酸的方法研究

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蛋白质和核酸等生物分子对维系生物个体的生命活动至关重要,这些生命物质在人体内的含量变化已成为疾病诊断的主要依据,因此,对蛋白质和核酸的分析检测对生物个体正常机能研究和疾病的诊断与治疗领域具有十分重要而现实的意义。比色检测技术具有所需仪器简单、价格低廉、可以目视检测,易于实现现场操作等优点,这些优点使得以比色检测为基础的生物分析检测技术在蛋白质和核酸的检测领域具有广泛的应用前景。但比色检测普遍存在检测灵敏度低的难题。针对此问题,本论文结合具有金属离子切割特性的8-17DNA酶和具有类辣根过氧化物酶的G-四链体DNA酶发展了一种基于DNA酶催化层叠信号放大的比色生物传感平台,并用于蛋白质和核酸的高灵敏,特异性检测分析。主要研究内容包括如下三方面:1.DNA链的酶切及DNA酶催化层叠信号放大比色传感平台的构建研究。本章利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法考察了具有3′→5′端方向酶切特性的几种酶对DNA以及DNA/蛋白质结合体的酶切作用,并考察了8-17DNA酶的切割特性。通过凝胶电泳分析结果,我们得出外切酶I(Exo I)具有较好的单链特异性酶切性质,而DNA/蛋白质结合体则不能被酶降解。此外,8-17DNA酶也具有很好的切割特性。基于这些实验结果,实现了酶催化信号放大比色传感平台的构建,为下一步检测应用打下了可靠基础。2.基于DNA酶催化信号放大的蛋白质比色分析。本章以血小板内源性生长因子PDGF-BB为检测对象,含有8-17DNA酶序列的核酸适体探针与PDGF-BB结合后具有抗酶切作用而不被Exo I降解,然后8-17DNA酶序列与发夹结构的类辣根过氧化物酶探针杂交,在PbS纳米晶作用下,发夹结构环部被剪切,封闭的G序列被释放出来,形成G-四链体结构引发显色反应,通过吸收信号的变化来实现PDGF-BB的检测。传感体系的响应信号在PDGF-BB浓度为0.02-5.0nM范围内呈良好的线性关系,检出限可达10pM,并具有很好的选择性。3.基于DNA酶催化信号放大的核酸单碱基多态性比色分析。本章以地中海贫血基因为检测对象,以磁纳米颗粒作为捕获探针固定基质,当目标DNA存在时,由于DNA连接酶的特异性连接作用使8-17DNA酶序列与捕获探针通过夹心反应连接到磁纳米颗粒上。磁分离后,加入发夹结构的类辣根过氧化物酶探针,在铅离子作用下释放G-四链体,进而引发显色反应达到检测单碱基多态性的目的。体系在目标DNA链浓度为2-100nM范围内呈良好的线性关系,检测限为0.97nM。
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