论文部分内容阅读
肝素属长链糖胺聚糖（GAG），由硫酸化的葡糖胺和己糖醛酸以β—1，4糖苷键交叉连接而成。低分子量肝素（LMWH）则是采用不同方法降解肝素获得的寡糖片段。与肝素相比，LMWH具有选择性强、抗血栓作用增强等特点，在临床上应用越来越广泛。不同降解方法所得到的肝素寡糖具有不同的结构，从而具有不同的生物学活性。与化学降解法相比，酶降解法制备LMWH具有反应条件温和、酶切位点清楚、不改变肝素结构以及不引入异物等特点。肝素裂解酶是一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出的。肝素酶的稳定性差，对其纯化过程会造成酶活性的巨大损失，因而产率很低。固定化酶技术因为可以克服酶稳定性差、易失活、不能重复利用等问题而备受关注。本研究以两株肝素黄杆菌为材料，在对其进行透性化处理提高通透性的基础上研究其最佳固定化条件，对制得的固定化细胞的理化性质进行研究，并进一步研究了固定化肝素黄杆菌降解肝素制备LMWH的反应条件、产物性质等，结果表明固定化细胞具有较好的操作稳定性和贮藏稳定性，在合适的反应条件下能够制备分子量较为均一、活性较好的LMWH。主要研究内容如下：
⑴完整的肝素酶活性测定体系的建立使用天青A（Azure A）法建立了肝素含量标准曲线，进而建立了完整的肝素酶粗酶液、透性化肝素黄杆菌以及固定化肝素黄杆菌的肝素酶活性测定体系，确保对酶活水平的测定贯穿整个研究的各个阶段，以准确地计算酶活回收率以及稳定性，作为考查粗酶液、透性化细胞以及固定化细胞的重要指标。
⑵肝素黄杆菌的培养及诱导条件的确定将两株肝素黄杆菌分别接种于DSMZ培养基和NBRC培养基，测定其生长曲线，选择NBRC培养基进行培养；将菌种于30℃、200r/min条件下培养一定时间至培养液OD600为1．0左右时加入无菌的肝素钠溶液进行诱导，通过对不同浓度肝素钠溶液诱导产酶的研究，确定诱导用肝素钠溶液的浓度为0．1 g/mL；为确保肝素黄杆菌保持菌株的纯正与较高的酶活水平，确定了使用初步筛选培养基培养、镜检、测定肝素酶活性和肝素酶I基因HepA PCR鉴定的多角度机制的菌种鉴定方法；分别使用超声波细胞破碎法和高压匀质法对培养和诱导后的肝素黄杆菌菌体进行破碎，得到肝素酶粗酶液，比较了两种方法破碎细胞的效果，确定使用高压匀质法制备肝素酶粗酶液；对粗酶液的操作稳定性和贮藏稳定性进行研究，结果表明粗酶液的酶活稳定性较差，反应5次后酶活性降低至10％以下，而保存于4℃时酶活性逐步降低，贮存120 h后酶活性降至35％左右。
⑶肝素黄杆菌的透性化处理分别使用曲拉通X—100（Triton X—100）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、吐温80（Tween80）以及溶菌酶对肝素黄杆菌进行透性化处理，考查各种透性化试剂处理的操作复杂性和作用效果，确定透性化处理的条件为使用等体积的100 mg/L的溶菌酶于30℃处理30 min，制得的透性化肝素黄杆菌的肝素酶活性回收率达到50％以上；对酶活稳定性的研究表明，透性化细胞的酶活稳定性较粗酶液有较大提高，在最初5个批次的反应过程中酶活性损失较明显，从第6次反应开始酶活基本保持平稳水平，经过10次反应后，酶活保留40％以上。
⑷透性化肝素黄杆菌的固定化使用海藻酸钙包埋法对透性化肝素黄杆菌进行固定化，通过正交试验确定固定化最佳条件为1．5％的海藻酸钠、5％的CaCl2溶液，硬化20 h；对固定化细胞的最适温度、温度稳定性、最适pH、pH稳定性等理化性质进行研究，确定了固定化细胞的最适温度为30℃，最适pH为7．0。与粗酶液相比，固定化细胞的温度稳定性有很大提高，最适温度、最适pH的范围有所扩大；在最佳条件下制备的固定化肝素黄杆菌的酶活回收率平均达到30％左右；固定化细胞的操作稳定性和贮藏稳定性相对于透性化细胞有很大提高，反应10次后酶活性保留60％以上，于4℃贮存120 h后酶活保留90％以上。
⑸固定化肝素黄杆菌制备LMWH使用固定化肝素黄杆菌对肝素进行三个批次的不同时间的酶解作用，经过超滤、浓缩及冻干后得到OH—1、OH—2和OH—3三组肝素寡糖样品，对制得的肝素寡糖进行190～350 nm波长范围扫描，显示在232 nm处有最大吸收；测定了三种肝素寡糖的部分理化性质，使用多角度激光散射仪．高效凝胶渗透色谱联用法（GPC—MALLS）测定肝素寡糖的分子量，三种肝素寡糖样品的重均分子量分别为8798 D、6709 D和5671 D，分散度（polydispersity）分别为1．375、1．383和1．408；采用羊血浆法测定肝素寡糖的抗凝效价，COATEST Heparin试剂盒测定其抗FXa活性，三种肝素寡糖样品的抗凝效价分别为26、15和11 USPU/mg，抗FXa活性分别为44、36和32IU/mg，抗FXa与抗FIIa活性的比值均大于1．5。