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流出道发育异常所导致的心脏流出道畸形，是较为常见的一类先天性心脏病，严重危害人类生命健康。流出道的分隔和重塑异常是大多数流出道结构畸形，如法洛四联症，大动脉转位(Transposition of the Great Arteries，TGA)，右室双出口等形成的根本原因。造成流出道畸形的因素非常复杂，包括环境因素和遗传因素等。然而，目前我们对于流出道畸形发生发展的机制却并不清楚。流出道发育过程中的细胞多样性、细胞分化轨迹和细胞调控网络的研究，将为流出道畸形的病因学研究提供重要依据。因此，本课题首先利用人类流出道畸形TGA队列进行临床特征和遗传病因学研究，随后从流出道发育的角度，利用无偏倚、高精度的单细胞转录组测序技术，对流出道及其关键细胞谱系的发育过程进行了全面解析。
在人类流出道遗传病因学的研究中，我们共招募了249例TGA患者(含66个Trio家系)，并进行了全外显子组测序。对不同TGA亚型的病例进行临床特征分析发现，完全型TGA中的动脉导管未闭发生率(52.7％)和先天矫正型TGA中的右位心/中位心发生率(32.8％)明显高于其他亚型。此外，我们还发现TGA患者合并肺动脉瓣二瓣化的比例也相对较高(9.6％)。为了寻找相关致病基因，我们对测序结果进行了一系列的生物信息学筛选，获得了82个候选基因，其中包括新发变异、功能丧失型变异、复合杂合和伴X连锁隐性变异。在这些候选基因中，除已知的先心病致病基因，如FOXH1，CITED2，我们还发现了19个含有罕见破坏性变异的纤毛基因:例如，含有新发变异的DYNC2LI1。纤毛基因的大量富集充分显示了纤毛在TGA发病机制中的作用。另外，从整体而言，有高达33％的TGA先证者有一个以上的可能有害变异，这表明一部分TGA可能存在寡基因或多基因遗传模式。
随后我们对流出道分隔的前、中、后，三个关键时期的细胞进行了单细胞转录组测序，对55611个单细胞数据分析发现其主要包括17个细胞亚型，共涉及6个细胞谱系。其中我们不仅发现了己被报道过的内皮-间充质转化的现象，而且还发现了间充质细胞向平滑肌细胞转化和心肌细胞向平滑肌细胞转化的现象。原位杂交结果显示，一组间充质细胞(Penk+)正在经历由间充质向平滑肌细胞的转变，这与流出道垫的融合有关。进一步，我们通过拟时间序列分析揭示了潜在细胞状态转换的动力学和涉及其中的关键转录调控因子。
心脏神经脊细胞(Cardiac Neural Crest Cells，CNCC)在流出道的发育中具有重要作用，对神经脊细胞进行消融可引起多种流出道畸形。为研究CNCC对整个心脏发育的贡献及其发育进程，我们对胚胎期第10.5天至出生后第7天的8个发育阶段的共34131个小鼠心脏的CNCC进行了单细胞转录组测序。通过单细胞分析和单分子荧光原位杂交技术，我们证实了有一部分壁细胞来源于CNCC。此外，我们发现了从CNCC来源的周细胞到微血管平滑肌细胞的转变，并通过拟时间分析鉴定了转化过程中的调控基因。我们的研究发现，CNCC后代在迁移到心脏时已经具有分化到特定谱系的趋势。在CNCC后代中我们也观察到，神经嵴细胞的相关分子特征随着发育过程逐渐丧失。最后，我们对CNCC后代中的一些特殊亚群的分布进行了描述，例如，Penk+细胞主要分布在形成主肺动脉间隔的流出道垫中，它们都来源于CNCC。
本研究对人类流出道畸形TGA的临床特征进行了系统性的总结和分析，对患者分层具有重要意义;同时，遗传分析的结果突出了纤毛基因的致病作用和TGA背后复杂的遗传结构。我们的研究结果不仅可以帮助改善TGA的产前诊断，也将在TGA患者的治疗和管理中起到重要指导作用。我们描绘了一个正常流出道及CNCC发育状态的参考图谱，发现了大动脉根部血管平滑肌谱系的多源性发育特征，首次证明心肌向血管平滑肌转分化的存在和神经脊细胞来源的壁细胞的存在。这些发现将为先心病的研究提供重要理论基础，并对先心病的细胞治疗产生重要意义。
在人类流出道遗传病因学的研究中，我们共招募了249例TGA患者(含66个Trio家系)，并进行了全外显子组测序。对不同TGA亚型的病例进行临床特征分析发现，完全型TGA中的动脉导管未闭发生率(52.7％)和先天矫正型TGA中的右位心/中位心发生率(32.8％)明显高于其他亚型。此外，我们还发现TGA患者合并肺动脉瓣二瓣化的比例也相对较高(9.6％)。为了寻找相关致病基因，我们对测序结果进行了一系列的生物信息学筛选，获得了82个候选基因，其中包括新发变异、功能丧失型变异、复合杂合和伴X连锁隐性变异。在这些候选基因中，除已知的先心病致病基因，如FOXH1，CITED2，我们还发现了19个含有罕见破坏性变异的纤毛基因:例如，含有新发变异的DYNC2LI1。纤毛基因的大量富集充分显示了纤毛在TGA发病机制中的作用。另外，从整体而言，有高达33％的TGA先证者有一个以上的可能有害变异，这表明一部分TGA可能存在寡基因或多基因遗传模式。
随后我们对流出道分隔的前、中、后，三个关键时期的细胞进行了单细胞转录组测序，对55611个单细胞数据分析发现其主要包括17个细胞亚型，共涉及6个细胞谱系。其中我们不仅发现了己被报道过的内皮-间充质转化的现象，而且还发现了间充质细胞向平滑肌细胞转化和心肌细胞向平滑肌细胞转化的现象。原位杂交结果显示，一组间充质细胞(Penk+)正在经历由间充质向平滑肌细胞的转变，这与流出道垫的融合有关。进一步，我们通过拟时间序列分析揭示了潜在细胞状态转换的动力学和涉及其中的关键转录调控因子。
心脏神经脊细胞(Cardiac Neural Crest Cells，CNCC)在流出道的发育中具有重要作用，对神经脊细胞进行消融可引起多种流出道畸形。为研究CNCC对整个心脏发育的贡献及其发育进程，我们对胚胎期第10.5天至出生后第7天的8个发育阶段的共34131个小鼠心脏的CNCC进行了单细胞转录组测序。通过单细胞分析和单分子荧光原位杂交技术，我们证实了有一部分壁细胞来源于CNCC。此外，我们发现了从CNCC来源的周细胞到微血管平滑肌细胞的转变，并通过拟时间分析鉴定了转化过程中的调控基因。我们的研究发现，CNCC后代在迁移到心脏时已经具有分化到特定谱系的趋势。在CNCC后代中我们也观察到，神经嵴细胞的相关分子特征随着发育过程逐渐丧失。最后，我们对CNCC后代中的一些特殊亚群的分布进行了描述，例如，Penk+细胞主要分布在形成主肺动脉间隔的流出道垫中，它们都来源于CNCC。
本研究对人类流出道畸形TGA的临床特征进行了系统性的总结和分析，对患者分层具有重要意义;同时，遗传分析的结果突出了纤毛基因的致病作用和TGA背后复杂的遗传结构。我们的研究结果不仅可以帮助改善TGA的产前诊断，也将在TGA患者的治疗和管理中起到重要指导作用。我们描绘了一个正常流出道及CNCC发育状态的参考图谱，发现了大动脉根部血管平滑肌谱系的多源性发育特征，首次证明心肌向血管平滑肌转分化的存在和神经脊细胞来源的壁细胞的存在。这些发现将为先心病的研究提供重要理论基础，并对先心病的细胞治疗产生重要意义。