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[目的]系统性红斑狼疮(SLE)的发病机制至今未完全清楚,但是T淋巴细胞功能失调在SLE的发病中具有重要的作用;另外,一些研究发现microRNA-181a(miR-181a)的异常表达与SLE发生、发展密切相关。近年来的科研及临床实验提示间充质干细胞(MSCs)对SLE患者具有一定的治疗作用,然而其机制并不太清楚。本课题将明确miR-181a的靶基因,并研究MSCs对SLE患者外周血T淋巴细胞中miR-181a和SLE相关炎症因子表达的影响,探讨SLE的发病机制及MSCs治疗SLE的作用机理。[方法]一、双荧光素酶报告基因载体分析microRNA-181a的靶位点。首先使用生物信息学软件预测microRNA-181a(miR-181a)的靶位点,选出最可能的下游靶基因进行下一步验证试验;然后构建靶基因质粒并将其转染于接种培养的HEK293T细胞;最后收集细胞样品检测萤火虫荧光素酶活性。二、microRNA-181a对T淋巴细胞的影响及机制。分别构建miR-181a及其靶基因OPN(SPP1)过表达、干扰表达的慢病毒载体以及相应的慢病毒对照载体,转导Jurkat细胞后获得稳转细胞株;收集各株细胞,提取总RNA及总蛋白质,采用Rt-qPCR定量检测各组OPN、NF-kB、TNF-α、β-catenin及miR181a的mRNA表达量,Western-blot方法检测OPN、NF-kB、TNF-α及β-catenin的蛋白表达量。三、间充质干细胞对系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞中microRNA-181a的影响及机制。1、将单独培养的Jurkat细胞及与人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)共培养不同时间段的Jurkat细胞分别进行取样,对OPN、NF-kB、TNF-α、β-catenin的mRNA及蛋白表达量及miR-181a的mRNA表达量进行检测;2、抽取SLE患者及健康对照者的全血并提取外周血单个核细胞(PBMC)后通过磁珠分选出总T淋巴细胞,分为SLE患者T淋巴细胞与UC-MSCs共培养组(SLE+UC-MSCs)、SLE患者T淋巴细胞单独培养组(SLE)、健康对照者T淋巴细胞与UC-MSCs共培养组(HC+UC-MSCs)、健康对照者T淋巴细胞单独培养组(HC);3、采用CCK8方法检测各组细胞的增殖活性,计算细胞活力及抑制率;ELISA方法对各组细胞的上清液中IFN-r、IL4、IL6及IL10的表达水平进行检测,并采用Rt-qPCR和Western-blot的方法对T淋巴细胞中OPN、NF-kB、TNF-α、β-catenin的mRNA及蛋白表达量、miR-181a的mRNA表达量进行检测。四、统计学方法:对所得数据采用SPSS19.0软件进行比较分析。[结果]一、双荧光素酶报告基因载体分析microRNA-181a的靶位点。miRNA mimic+H_TNF WT+TK(91.88±1)和miRNA mimic+H_SPP1 WT+TK(65.6±0.71)的荧光表达较其他各组明显降低,差异有统计学意义(p<0.05)。二、microRNA-181a对T淋巴细胞的影响及机制。OPN(SPP1)过表达细胞株的OPN、TNF-α、NF-kB及β-catenin的mRNA及蛋白的表达明显增高,而miR-181a的mRNA表达则明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);相反,OPN干扰细胞株的OPN、TNF-α、NF-kB及β-catenin的mRNA及蛋白的表达明显降低,miR-181a的mRNA表达则表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-181a过表达细胞株的OPN、TNF-α、NF-kB及 β-catenin的mRNA及蛋白的表达明显降低,miR-181a的mRNA表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);相反,miR-181a干扰细胞株的OPN、TNF-α、NF-kB及β-catenin的mRNA及蛋白的表达则明显增高,miR-181a的mRNA表达则表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。三、间充质干细胞对系统性红斑狼疮患者T淋巴细胞中microRNA-181a的影响及机制。1、与单独培养的Jurkat细胞相比较,与UC-MSCs共培养的Jurkat细胞的OPN、TNF-α、NF-kB及β-catenin的mRNA及蛋白的表达量明显降低,miR-181a的mRNA表达则表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);2、CCK8检测显示SLE组的增殖活性比HC组明显增高,而SLE+UC-MSCs组较SLE组明显下降(p<0.01)。同时,SLE+UC-MSCs较HC+UC-MSCs细胞活力明显降低、抑制率明显增高(p<0.001);3、ELISA方法检测显示SLE组培养细胞上清液中IFN-r、IL4、IL6及IL10的测得值明显高于HC组,但是在SLE+UC-MSCs共培养组中的检测值却明显降低,差异均有显著性(P<0.01或0.001);4、RT-qPCR的结果显示,SLE组与HC组相比较,T淋巴细胞中的OPN、TNF-α、NF-kB及β-catenin的表达明显增高,而miR-181a明显降低,差异均有显著性(P<0.001)。而SLE+UC-MSCs组与SLE组相比较,T淋巴细胞中TNF-α、NF-kB、OPN及β-catenin的表达明显下降,miR-181a的表达明显增高,差异均有显著性(P<0.008或0.001);5、Western-blot的结果显示,SLE组T淋巴细胞中OPN、TNF-α、NF-kB及β-catenin的蛋白表达量明显高于HC组(P<0.001),SLE+UC-MSCs组T淋巴细胞中OPN、TNF-α、NF-kB及β-catenin的蛋白表达量相较于SLE组明显下降(P<0.001)。[结论]miR-181a的过表达对SLE患者T淋巴细胞中SLE相关的通路蛋白及炎症因子具有显著的抑制作用,miR-181a的表达下调可能促进了 SLE的发生、发展;体外实验表明MSCs可以抑制SLE患者的T淋巴细胞中OPN、TNF-α、NF-kB、β-catenin及其他炎症因子的表达,上调miR-181a的表达,说明MSCs对SLE患者的T淋巴细胞可以产生明显调节作用。我们推测在人体内MSCs可能通过上调miR-181a来抑制T淋巴细胞中SLE相关炎症因子的表达而发挥对SLE的治疗作用。