蛹虫草Cu,Zn超氧化物歧化酶的研究

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C.militaris是一种昆虫寄生真菌,在生物控制中起到重要的作用。在其定植于寄主体内的过程中,遇到的首要问题是寄主的高活性氧的阻抗反应环境。超氧化物歧化酶是消除这一环境对其生存所造成危害的一类关键酶。 本研究通过累加营养的方式分析了碳源、氮源和微量元素对蛹虫草菌丝体液体培养中细胞的生物量、SOD、CAT和LPO的影响,揭示菌体中抗氧化酶在一般环境中的代谢规律和特性。结果表明,高浓度的葡萄糖降低SOD和CAT的酶活力;Cu2+、Zn2-、Mn2+有利于提高SOD的酶活力;Zn2+能明显降低细胞的脂氧化水平。蛹虫草菌丝体对高浓度Cu2+、Zn2+有很强的抗性;虽然两种离子都能提高菌体内SOD、CAT酶活力,但是,二者的作用机制不同。Cu2+能明显提高菌体内的SOD酶活力;而Zn2+对提高CAT酶活力、降低细胞LPO水平非常有效。 蛹虫草菌丝体含有两种SOD同工酶:Cu,Zn-SOD(cm-SOD)和Mn-SOD,Mn-SOD的含量远远低于Cu,Zn-SOD的量。经过下列四个纯化步骤:(NH4)2SO4沉淀、DEAE-FF阴离子交换柱、CM-650阳离子交换柱和G100分子筛,蛋白收率7%,比活达到11962.1U.mg-1protein,纯化倍数226.1倍。氨基酸序列(N-端12个氨基酸序列)和其它来源Cu,Zn-SOD相似,每个亚基含有一个铜离子和一个锌粒子,紫外吸收光谱266nm,对KCN和H2O2敏感,低浓度的NaN3、β-mercaptoethanol、DTT、PMSF、TritonX-100对酶活力几乎没有影响。 从C.militarisSH菌丝体中获得了其cm-SOD的cDNA基因克隆,以质粒pET-21a(+)为载体,在大肠杆菌中获得了可溶性表达。在大肠杆菌菌株培养中,补加葡萄糖有利于细胞生物量的积累和重组蛋白的表达;而Cu2+明显提高SOD的酶活力。外源cm-SOD在E.coli中的高效表达,提高了细胞中SOD的酶活力,菌体CAT的酶活力也得到有限的提高,降低了细胞中的超氧离子的浓度,提高了菌体抗自由基的能力。 重组蛋白经过DEAE-FF阴离子交换柱、CM-52阳离子交换柱和G-100分子筛,纯化倍数6.1倍,比活力27272.7U.mg-1protein。毛细管电泳分析其纯度为94±1%。重组蛋白等电点(pI7.0),分子量(31670Da),热稳定性等特征和天然cm-SOD的相应特征一致。菌株在LB培养基中表达的重组蛋白(R-cm-SOD)多数以apo-cm-SOD的形式存在;经过DEAE-FF阴离子交换柱和CM-52阳离子交换柱可以纯化得到电泳纯的apo-cm-SOD蛋白。在apo-cm-SOD的溶液中加入Cu2+和Zn2+可以重新构建具有酶活力的cm-SOD。 冬虫夏草(C.sinensis)是传统的中草药和保健品,具有多种药理活性和功能。采用固体发酵技术获得冬虫夏草固体发酵粉,其在肾衰竭的治疗中有良好的效果。本研究对一种冬虫夏草(C.sinensis)菌丝体固体发酵粉的化学成份进行了分析,包括粗成份、生物活性成份、脂肪酸、氨基酸和金属元素等。结果:冬虫夏草菌丝体固体发酵粉中3--脱氧腺苷含量40.81μg/g、腺苷含量745.4μg/g;甘露醇的含量为165.8mg/g;不饱和脂肪酸是优势脂肪酸,以亚油酸和油酸为主。各种氨基酸的含量和水平与冬虫夏草子实体中相应氨基酸的含量和水平相当;虫草发酵粉中的其他化学成份和冬虫夏草子实体中相应成份基本一致。
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