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第一部分：问号钩端螺旋体趋化信号转导相关基因功能研究
细菌为了更好地生存会向有利于自己的环境移动，避开不利于自己的环境，细菌的这种运动方式就是趋化。趋化不仅是细菌维持生存的一种运动方式，而且有研究表明：趋化在致病过程中起到一定作用，可以帮助病原菌穿越宿主的组织屏障。
自2003年以来，已有四株致病性钩端螺旋体的全基因组序列得到测定，从基因组提供的信息发现：钩端螺旋体具有复杂的趋化信号转导系统，问号钩端螺旋体赖型56601株大染色体上有多个同源趋化蛋白编码基因包括12*MCP编码基因，2*cheA，3*cheW,6*cheY,3*cheB，2*cheR,2*cheD，l*cheX,除了具有多拷贝的特征外，我们在对2个cheA基因编码蛋白的结构域进行分析时发现：在CheA1中，除了保守的P1，P2，P3，P4，P5结构域外，还包含1个与CheC磷酸酯酶家族同源的结构域P6，而在CheA2中，负责与下游反应调节蛋白结合从而将磷酸基团转移的P2结构域区域被一段未知功能的氨基酸序列取代。特殊的结构域组成暗示了在问号钩端螺旋体中该组氨酸蛋白激酶的功能可能与现在已知的同类蛋白的功能有所不同，并进而导致信号转导的差异。
在本课题中，首先通过Escherichia coli异源互补的方法，将问号钩端螺旋体的CheA1、CheA2编码基因克隆入E.coli的cheA缺陷株中以检验是否可以回补E.coli中CheA功能，结果表明:CheA1可以使Ecoli的cheA缺陷株的趋化能力得到一定程度的恢复，而CheA2则没有此功能。
在问号钩端螺旋体中，有多个位于CheA类蛋白信号转导下游的反应调节蛋白，是否这些蛋白都具有功能，都可以接收组氨酸蛋白激酶的信号？CheA2不能互补Ecoli中CheA的功能是否是因为P2结构域缺失造成信号不能向下游传递，CheA1中的P6结构域是否具有磷酸酯酶的功能都需要进一步验证。因此，将问号钩体中的CheA1、CheA2、CheY1、CheY2、CheY3、Che24、CheY5、CheY、CheB1、CheB2、CheB3进行了基因克隆，蛋白表达和纯化，使用纯化的蛋白进行磷酸基团转移实验，体外磷酸基团转移实验结果表明：
1、CheA1具有自磷酸化功能，CheA2不具有自磷酸化功能，说明CheA2不能回补E.coli的cheA缺陷株的功能的原因不在于不能将信号向下游传递，而是该蛋白已经不具有自磷酸化的能力。
2、自磷酸化的CheA1可以将磷酸基团转移到CheY1、CheY5、CheY、CheB1上，说明问号钩体中起作用的反应调节蛋白为CheY1、CheY5、CheY、CheB1。CheY2、CheY3、CheY4、CheB2、CheB3可能自身已经失去功能，或者失去了上游的信号供体蛋白。
3、CheA1具有加速被磷酸化的CheY1去磷酸化的能力，该功能的行使主要是通过P6结构域进行。
因为CheA1中的P6结构域被证明具有去磷酸化的能力，那么我们对问号钩体中的另外一个属于CheC磷酸酯酶家族的CheX蛋白的功能也进行了验证。试验结果表明：CheX可以互补Escherichia coli cheZ缺陷株的趋化能力。体外磷转移实验也证明该蛋白具有去磷酸化的能力。@以上的研究结果揭示了问号钩体趋化信号转导过程中起作用的基因，并且证实了CheA1具有激酶和磷酸酯酶的双重功能。
第二部分：问号钩端螺旋体流感伤寒群临海型56609v株全基因组测序
钩端螺旋体是一类在进化和分类上比较特殊的微生物，其中，致病性钩端螺旋体可以引起钩端螺旋体病（简称钩体病），钩体病在我国为法定乙类传染病，虽然上世纪八十年代后，钩体病疫情相对稳定，但钩体病疫区常出现爆发疫点。近年来，钩体病的发病率在国内外都有所上升，目前已有91个国家和地区证实有该病存在。
到目前为止钩端螺旋体中并未发现明确的致病因子，它的致病性是由多种因素所决定，是与宿主相互作用，共进化的结果，因此，增加了其致病机制研究的难度。此外，有效的遗传操作技术的缺乏也使钩端螺旋体分子致病机理的研究进展缓慢。钩端螺旋体全基因组测序和基因功能分析使得困扰这一研究领域的问题得到了有效的解决方法和思路，自2003年以来，我国科学家和巴西以及澳大利亚科学家已相继发布了四株不同的致病性钩端螺旋体的全基因组序列，从中发现了潜在的与致病相关的基因，并且通过比较基因组学的方法揭示了不同菌株在宿主间传播方式差异的分子基础。
钩端螺旋体分为17个基因种，200多个血清型，在我国流行的主要有10个血清型，不同血清型钩体引起人类疾病的临床表现和病程不同，我们研究组选取了我国流行的问号钩端螺旋体中的临海型、七日热型、犬型、秋季型、波摩那型、巴叶赞型、澳洲型、致热型中的代表致病菌株进行全基因组测序，通过对不同血清型的菌株基因组的分析和比较以期寻找到更多分子致病机制的线索，并且通过比较基因组的方法分析造成不同血清型菌株临床表现差异的原因。
本课题对其中的流感伤寒群临海型56609v菌株进行了全基因组测序。采用了焦磷酸测序法和传统的双脱氧末端终止法(Sanger法)相结合的方法，首先，使用GenomeSequencer FLX System(GS FLX，454 Life Sciences)进行大规模测序。共得到554443条高质量的序列读长(reads)，达基因组全长29.6倍的覆盖率(coverage)，经软件拼装(de novassembly)，生成了295个重叠序列群(contig)。然后，选取长度大于500 bp的235个Large contig与问号钩端螺旋体赖型56601株及哥本哈根型Fiocruz Ll-130株全基因组序列做blastn比对，以排定contig彼此间的位置关系。在此基础上采用PCR及3730Sanger测序的方法进行缺口填补工作，最终得到两个环状染色体：Chromosome I和Chromosome II及一个游离于染色体外的小环(contig552)。最后，通过对低质量区域(weak region)的重新PCR及测序，使两条染色体及小环序列的错误率降至0.05/10kb。
虽然，Gap填补结束后，得到了两个完整的环状染色体，但是游离在染色体外的contig552究竟是由于拼接或者后期的Gap填补过程中的错误而造成没有找到其在染色体上的正确位置，还是它确实是游离于染色体之外，需要进一步的验证，对eontig552进行了开放阅读框预测和功能注释来寻找它独立成环在基因组成上的证据，发现其上存在与质粒复制分离相关的蛋白的编码基因，并且存在噬菌体相关的蛋白，可能为具有复制能力的原噬菌体片断。关于其复制能力的试验正在进行中。因为还无法确定contig552在基因组中的确切位置，是否游离于染色体之外，所以对全基因组序列的分析及比较基因组分析会在将来的工作中进行。
本课题获得了问号钩端螺旋体流感伤寒群临海型56609v株全基因组序列，发现了一个可能游离于染色体之外的环状原噬菌体片断，为将来进行的基因组功能分析，不同血清型菌株比较基因组研究奠定了基础，此外，可能处于游离状态的环状原噬菌体片断的发现为将来以此为基础的问号钩端螺旋体遗传操作载体的构建提供了可能。