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Rac/ROPGEFs(Guanine Nucleotide Exchange Factor)称为Rac/ROP鸟嘌呤核苷酸交换因子,它是小G蛋白Rac/ROP的上游活化因子,催化小G蛋自由GDP结合态转化为GTP结合态。Rac/ROP作为分子开关调节植物多种生长发育以及参与多种信号途径,其中包括调节花粉管的生长、根毛的发育、过氧化氢的产生以及参与生长素、脱落酸等植物激素的信号转导途径。拟南芥基因组中有14个Rac/ROPGEFs,是近年来鉴定的一个新的基因家族。此家族成员序列都含有一个保守的结构域被称为(PRONE)结构域,此结构域对GEF活化Rac/ROP具有重要作用。关于植物Rac/ROPGEFs生物学功能的研究目前比较少,只见三例报道Rac/ROPGEF调控拟南芥、烟草和番茄花粉管的极性生长。
本论文通过T-DNA插入突变体和转基因植株的分析,对ROPGEF6、GEF5功能进行了初步研究,获及如下的结果:
1.构建了植物表达载体并获得转基因植株
我们构建了GEF6p::GUS、GEF5p::GUS载体并获及它们的转基因植株,此外还构建了拟南芥Rac/ROPGEF6、GEF5载体,成功获得了GEF6、GEF5过表达与RNA干涉的转基因植株。
2.GEF6基因表达谱的分析
我们首先通过GUS组织化学染色法分析GEF6基因的表达模式,发现GEF6在整个胚胎都有表达且在胚胎发育早期阶段(2细胞期)就开始表达,在心型胚至成熟胚阶段在根极及其周围细胞表达增强。胚后发育阶段,GEF6在根分生组织表达和侧根原基表达。此外,在幼苗地上部分,GEF6在叶片气孔保卫细胞处表达。在成熟植株中我们观察了花器官中的表达情况,发现GEF6在花柱的基部表达。
3.GEF5基因表达谱的分析
通过GUS组织化学染色法分析GEF5基因的表达模式,发现在胚胎发育阶段球型胚和心型胚时期GEF5在整个胚胎都有表达,活性很强。胚后发育过程中,我们对GEF5启动子在幼苗不同器官和花的表达活性进行了分析。结果表明,GEF5在维管组织表达包括幼苗主根的维管组织、幼苗侧根的维管组织、胚轴维管组织、子叶维管组织和花的维管组织。同时也在侧根原基启动部位附近的内皮层表达。在成熟植株中我们观察了GEF5在花器官中的表达情况,发现在柱头和花药以及花柄的基部表达。
4.gef6 T-DNA插入突变体鉴定与胚胎发育表型分析
我们鉴定了gef6 T-DNA插入突变体,获及2个T-DNA插入纯合体,gef6-1与gef6-3。通过对突变体表型进行分析,我们发现突变体胚的发育有明显缺陷。在胚的顶细胞进行第一次分裂时,细胞板的方向发生改变,导致胚的顶-基轴分界不明显,从而影响胚在随后阶段如球型胚的发育,出现较高频率的顶端发育缺陷。此外,在心型胚阶段我们也观察到胚的根极细胞分裂异常,细胞板排列方向改变,严重的表型不能形成QC和根冠干细胞前体。这些观察结果说明,GEF6基因可能影响早期胚的极性建立,从而影响细胞不对称分裂的发生。
5.gef6突变体胚后发育表型分析
对gef6突变体幼苗进行根生长速率分析,结果发现gef6突变体幼苗形态发育基本正常;gef6-I突变体幼苗的主根比野生型对照稍短,分生组织细胞数有所减少;而gef6-3突变体幼苗的主根明显短于野生型对照,分生组织长度明显变短。
6.YFP标记的GEF6及GEF5融合蛋白亚细胞定位分析
我们在原生质体细胞分别表达YFP标记的GEF6及GEF5,结果显示YFP-GEF6融合蛋白主要定位于细胞膜上,YFP-GEF5融合蛋白定位于细胞膜上及附近的细胞质中。