大肠杆菌yigP基因位点的功能探查

来源 :华东理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:robbieqzl
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作为原核细菌模式生物的大肠杆菌尽管早在三十年前就已完成全基因组测序,但迄今仍有近一半基因的功能未知或未经实验证实。本实验室前期工作发现,位于大肠杆菌辅酶Q8生物合成操纵子(ubiEB)内的yigP基因位点与细菌在有氧条件下的正常生长相关,但在基因组数据库中,该基因的注释为编码“未知蛋白”。为此,本文聚焦于大肠杆菌yigP基因位点的生物功能和表达调控探查。主要结果如下:  第一,由靶向yigP基因位点不同区域的两对引物介导的实时荧光定量PCR结果显不,yigP基因位点表达两种部分序列重叠的RNA产物。其中之一为检测时相内全程表达的长转录产物ubiJ-RNA;另一种则是起始于yigP基因位点3’端且仅在对数生长后期表达的短转录产物esrE-RNA。yigP基因位点的体内蛋白产物分析连同esrE编码序列的移码回补实验结果表明,ubiJ-RNA翻译蛋白质UbiJ;而esrE-RNA则属于非编码RNA(命名为EsrE)。  第二,针对yigP基因位点的功能探查发现,该位点的大肠杆菌缺失突变株呈生长阻滞、克隆小型化、辅酶Q8产量降低、抗生素敏感性变更等相关表型。而且,UbiJ或EsrE的反式回补均能逆转yigP缺失突变株的上述表型。重要的是,这些表型最终交汇于细菌的有氧呼吸,因而大肠杆菌细胞中可能存在一条由UbiJ和EsrE控制的辅酶Q8生物合成-小克隆突变-抗生素敏感性轴线,而这一轴线的基础便是细胞的有氧呼吸。  第三,针对EsrE下游作用靶点的筛查结果表明,该sRNA潜在调控涉及细胞不同生理过程的多种mRNA靶点,包括肽聚糖的生物合成和三羧酸循环;EsrE对靶点的调控模式也呈现多样性,既有正向调控也有负向调控。其中,针对靶点sdhD的进一步生化研究显示,EsrE促进大肠杆菌胞内琥珀酸脱氢酶的表达。上述结果同时也支持EsrE控制细菌的有氧呼吸,并且在体内发挥多重生理功能。  第四,基于亲和捕获技术对调控EsrE转录的反式作用因子的筛查,获得了多个候选蛋白。针对其中Fur蛋白所进行的体内和体外验证实验结果显示,当细胞内Fe2+充足时,Fur蛋白能够结合esrE基因上游的转录调控元件进而促进EsrE的表达。  综上所述,本文首次解析了yigP基因位点在维持大肠杆菌有氧条件下正常生长中所扮演的重要角色,揭示了该基因位点的多重转录特征及其潜在的上游调控因子和下游效应靶点,为大肠杆菌的功能基因组增添了一个经实验验证的新成员。同时,本文还首次分析了由yigP缺失所介导的大肠杆菌小克隆突变株对不同抗生素敏感性呈多向性变化的内在机制,并由此建立了大肠杆菌细胞内以有氧呼吸为核心的辅酶Q8生物合成-小克隆突变-抗生素敏感性轴线,后者可为临床开发致病菌小克隆突变株的抗生素治疗策略提供理论指导。
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