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目的心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)涉及钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡与细胞自噬等多种分子机制,其中自噬是近年来抗MIRI的研究热点。自噬是一个动态变化的过程,自噬这一完整的动态变化过程被称为自噬流。白藜芦醇是一种多酚类化合物,近年研究发现其可缓解MIRI。本课题组前期研究发现,白藜芦醇可抑制缺氧心肌细胞内乳酸脱氢酶的漏出,增加抗氧化酶GSH-Px的表达水平,减轻心肌细胞缺氧损伤;进一步研究发现,白藜芦醇缓解心肌细胞/缺氧复氧损伤可能与调控自噬有关。在此基础上,本研究以自噬流为切入点,探寻缺氧/复氧损伤心肌细胞内自噬流的状态,考察白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞的药效,探究其药效与调控自噬流的关系,为白藜芦醇防治MIRI的研究提供依据。方法和结果首先通过体外实验培养大鼠乳鼠心肌细胞,分别于三气培养箱与CO2培养箱中进行缺氧12 h、复氧12 h的造模处理,复制心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。1.缺氧/复氧损伤心肌细胞内的自噬流的研究借助自噬流抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)考察心肌细胞自噬流状态,细胞融合率达到80%后,将其分为如下4组:正常对照组(Control组)、正常对照+氯喹组(10 μmol/L氯喹,Control+CQ组)、缺氧/复氧损伤组(H/R组)以及缺氧/复氧损伤+氯喹组(10μmol/L氯喹,H/R+CQ组),氯喹存在于心肌细胞缺氧期与复氧期,共处理24h。随后采用Western Blot法检测心肌细胞内自噬流标志性蛋白Beclin 1、LC3与p62的表达水平,免疫荧光技术观察LC3的定位与分布,评价缺氧/复氧损伤心肌细胞内自噬流状态。结果发现:与Control组相比,H/R组Beclin 1表达增加,表明缺氧/复氧心肌细胞内自噬可能被激活,而LC3与p62表达水平相比Control组有下降趋势,出现这种结果有两种可能,即缺氧/复氧可能抑制心肌细胞自噬或加快心肌细胞自噬流;H/R+CQ组相比于与Control+CQ组LC3-Ⅱ与p62表达升高,LC3点聚现象增加,LC3阳性细胞率升高,表明缺氧/复氧心肌细胞内自噬被激活,排除了缺氧/复氧抑制心肌细胞自噬的可能,而H/R组LC3与p62表达水平较低则是由于自噬流加快引起的。综上可知,缺氧/复氧可激活心肌细胞自噬,且自噬流加快。2.白藜芦醇对缺氧复氧损伤心肌细胞的药效学研究设置8个白藜芦醇药物浓度梯度,细胞融合率达到80%后,将其分为如下10组:正常对照组(Control组)、缺氧/复氧损伤组(H/R组)以及1、2.5、5、10、20、40、80 与 160 μM白藜芦醇预处理组(1、2.5、5、10、20、40、80 与 160 μmol/L 白藜芦醇,Res-1 组、Res-2.5 组、Res-5 组、Res-10组、Res-20组、Res-40组、Res-80组、Res-160组),白藜芦醇预处理12h后再对心肌细胞行缺氧、复氧的造模处理。随后采用CCK-8法与LDH比色法检测心肌细胞活力与乳酸脱氢酶漏出率,进行白藜芦醇量效关系考察,选取合适的白藜芦醇的给药浓度,增加氯喹的作用,随后再将实验分为如下5组:正常对照组(Control组)、缺氧/复氧损伤组(H/R组)、5 μM白藜芦醇预处理组(5μmol/L白藜芦醇,Res-5组)、20 μM白藜芦醇预处理组(20 μmol/L白藜芦醇,Res-20组)以及20 μM白藜芦醇+氯喹组(20 μmo 1/L白藜芦醇+10μmol/L氯喹,Res-20+CQ组),白藜芦醇预处理12 h后再对心肌细胞行缺氧、复氧的造模处理,氯喹则存在于心肌细胞缺氧期与复氧期,共处理24 h。随后于光学显微镜下观察心肌细胞形态,并用CCK-8法、LDH比色法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪技术分别检测心肌细胞活力、乳酸脱氢酶漏出率以及细胞凋亡率,探索白藜芦醇抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。结果发现:与Control组相比,H/R组心肌细胞活力下降约33%,乳酸脱氢酶漏出率升高(P<0.005,P<0.01 vs.Control组),表明缺氧/复氧对心肌细胞造成一定程度的损伤;与H/R组相比,5 μmol/L～40 μmol/L白藜芦醇可显著增加心肌细胞活力,其中20μmol/L白藜芦醇预处理可使心肌细胞活力增加25%,保护效果最明显(P<0.01 vs.H/R组);20 μmol/L与40μmol/L白藜芦醇可显著降低乳酸脱氢酶漏出率(P<0.05 vs.H/R组)。当给药浓度升高至80 μmol/L以上,缺氧/复氧损伤心肌细胞活性反而降低,且乳酸脱氢酶漏出情况未见改善,表明低浓度的白藜芦醇可发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用。在确定了白藜芦醇的有效浓度范围后,本研究选取5μmol/L与20 μmol/L作为白藜芦醇的给药剂量,5 μM白藜芦醇组与20μM白藜芦醇组相比H/R组,缺氧/复氧损伤心肌细胞生长状态明显改善,心肌细胞活力增加,乳酸脱氢酶漏出率降低,且心肌细胞凋亡被抑制,然而Res-20组在加入氯喹后心肌细胞活力反而下降,乳酸脱氢酶漏出率增加,细胞凋亡率升高,表明氯喹可抵消白藜芦醇的心肌细胞保护作用,提示白藜芦醇的药效可能与调控细胞自噬有关。3.白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞内自噬流的影响为考察白藜芦醇对自噬流的调控作用,在白藜芦醇预处理12 h后、缺氧/复氧造模处理之前,收集心肌细胞检测LC3的表达,实验发现,在造模之前白藜芦醇已经活化心肌细胞自噬流。基于此结论,再将细胞分为正常对照组(Control组)、缺氧/复氧损伤组(H/R组)、5μM 白藜芦醇预处理组(Res-5组)、20 μ白藜芦醇预处理组(Res-20组)以及20 μM白藜芦醇+氯喹组(Res-20+CQ组),白藜芦醇预处理12 h后再对心肌细胞行缺氧、复氧的造模处理,氯喹则存在于心肌细胞缺氧期与复氧期,共处理24 h。采用Western Blot法检测心肌细胞内Bec]in 1、LC3和p62表达水平,免疫荧光技术观察细胞内LC3的分布情况,考察白藜芦醇对缺氧/复氧损伤心肌细胞内自噬流的调控作用。结果发现:与H/R组相比,5 μM白藜芦醇组与20 μM白藜芦醇组Be clin 1、LC3与p62表达均增加,LC3荧光点聚现象增强,LC3阳性细胞率较高,其中,白藜芦醇20 μmol/L组LC3表达水平是缺氧复氧损伤组的1.7倍(P<0.05 vs.H/R组),Beclin 1上调以及LC3阳性细胞率的增加均表明白藜芦醇可激活心肌细胞自噬;而LC3与p62的升高则有两种可能:①白藜芦醇激活心肌细胞自噬,促进自噬体生成;②白藜芦醇不影响自噬的激活,仅仅抑制自噬溶酶体降解,阻断自噬流;与Res-20组相比,Res-20+C Q组LC3与p62表达进一步升高,则排除了白藜芦醇仅仅抑制自噬溶酶体降解的这一结论,可见白藜芦醇激活缺氧/复氧损伤心肌细胞自噬。综上,白藜芦醇可激活缺氧/复氧心肌细胞自噬,白藜芦醇预处理在缺氧/复氧造模处理之前已经活化自噬流,使心肌细胞提前进入应激防备状态,缓解缺氧/复氧损伤所致的自噬流过度活化,调节适度自噬。结论1.缺氧/复氧损伤心肌细胞内自噬流过度活化,这可能是心肌细胞损伤的原因之一。2.低浓度的白藜芦醇可缓解心肌细胞缺氧/复氧损伤,高浓度白藜芦醇反而加重心肌细胞缺氧/复氧损伤,且白藜芦醇的心肌细胞保护作用可能与调控自噬流有关。3.白藜芦醇预处理可活化心肌细胞自噬流,抑制缺氧/复氧损伤心肌细胞自噬流过度活化,调控心肌细胞适度自噬,进而发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用。