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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)在2015年中国恶性肿瘤发病率中位列第四位,死亡率中位列第三位,是较为凶险的一种癌症类型。最佳的治疗方法依然是早期手术切除。据相关机构统计,肝癌在通过手术切除后5年的复发率依然高于60%,小肝癌经过完整切除后也有40%以上的复发率[1]。研究显示肝癌术后复发与患者免疫功能有着高度相关性,在围手术期,手术创伤引起的应激反应可抑制患者免疫功能,使机体的免疫功能无法有效抑制残余癌细胞的增殖和扩散,导致术后肿瘤转移的风险增加,与其他部位癌症相较,患者五年生存率低,生活质量差[2]。因此,如何避免肝癌的复发和转移成为治疗肝癌的重点,改善肝癌患者术后免疫功能对于提高肝癌患者的长期存活率具有重要意义。现代医学建议运动疗法作为肿瘤术后康复的主要治疗手段之一,适度且有规律的长期运动对机体的免疫功能有很好的提高作用,具体主要体现在提高免疫细胞及相关免疫因子的活性。且有动物实验表明,中等强度的长期运动锻炼对缓解和抑制肿瘤细胞的生长扩散有帮助[3]。中医药作为补充替代肿瘤学的主要手段之一,大大丰富了肿瘤康复的内容。早在春秋战国时期就出现导引术,作为呼吸运动和躯体运动相结合的医疗体育方法。导引术最早见于《庄子·刻意》,在《金匮要略》中就已出现用导引术治疗相关疾病的条目。在马王堆汉墓中出土的《导引图》中详细记载了44幅小型全身导引图。至隋朝,导引术正式作为医疗手段之一由太医院颁布,记载于巢元方的《诸病源候论》中,并提出肝脏疾病的导引治疗方法。但是肿瘤的发生发展机制是十分复杂的,目前关于运动对肝癌术后患者的影响尚缺乏相关资料,尚无一套明确且规范的运动方案用于肝癌患者术后康复,也缺乏该阶段运动与免疫状态相关的客观理论依据。综上所述,本研究构建了肝原位移植瘤切除术后小鼠模型,并对模型小鼠术后自发活动度、肝功能、淋巴细胞细胞功能等进行研究,探索模型小鼠在术后一般状态及免疫功能的恢复情况。在分析模型小鼠术后状态后,在术后不同时间对小鼠进行不同强度的跑台运动,观察运动对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响并进一步研究运动对小鼠淋巴细胞增殖能力影响的分子机制,为后续实验奠定基础。第一部分:肝原位移植瘤切除术对小鼠一般状态及免疫功能的影响目的:构建肝原位移植瘤切除术后小鼠模型,观察手术对小鼠一般状态和免疫功能的影响。方法:1、构建肝原位移植瘤切除术后小鼠模型,采用自发活动仪观察模型小鼠术后不同时间节点(术后第一天、第三天、第五天、第七天、第九天)自发活动度水平。2、采集模型小鼠外周血,检测其血清白蛋白(albumin,ALB)、胆红素(total bilirubin,TB)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)分泌水平。3、制备模型小鼠脾淋巴细胞悬液,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测其IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等细胞因子分泌水平。4、MTT比色法检测各组模型小鼠脾淋巴细胞增殖能力。5、流式细胞术检测模型小鼠脾淋巴细胞表面CD4+/CD8+比例。结果:1、本研究结果表明,模型小鼠术后第一、三、五天的自发活动总路程分别为(782.54±142.95)cm、(932.22±46.90)cm、(1040.57±208.83)cm,与正常组小鼠(1291.06±79.96)cm相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。第七天模型小鼠自发活动总路程(1212.07±85.50)cm和第九天模型小鼠自发活动总路程(1144.11±59.79)cm与正常小鼠比较,差异无统计学意义。2、通过检测小鼠血清发现,模型小鼠术后第一天肝功能损伤最为严重,除ALB外,TB为(2.4±0.16)umol/L、ALT为(364.00±46.5)u/L、AST为(1453.60±295.29)u/L、LDH为(2853.60±249.73)u/L均远高于正常小鼠,差异具有统计学意义。其中,ALT、AST、LDH趋势一致,均在术后快速升高,第一天即达到峰值,之后逐步下降。TB的升高迟于转氨酶的变化,结果显示,TB在术后第一天上升(2.4±0.16)umol/L,第三天达到峰值(2.42±0.23)umol/L,后逐步下降。ALB各组之间差异无统计学意义。3、术后第一天和第三天小鼠淋巴细胞转化率分别为(85.27±0.04)%和(97.54±0.16)%,均小于正常小鼠(172.38±0.21)%,差异有统计学意义(P<0.05),但小鼠的免疫功能在逐步恢复,术后第七天淋巴细胞增殖能力为(128.51±0.27)%,较第一天小鼠的免疫功能有所提高。4、术后小鼠各个炎症细胞因子分泌水平远高于正常小鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。除TGF-β外,各个细胞因子均在术后快速升高,第一天即达到峰值,之后逐步下降。说明手术破坏了Th1/Th2类细胞因子平衡,导致Th极化漂移,产生免疫紊乱。5、在本实验中,术后第一天组小鼠淋巴细胞CD4+/CD8+比值为(1.61±0.33),术后第三天组小鼠淋巴细胞CD4+/CD8+比值为(3.21±0.45),术后第五天组小鼠淋巴细胞CD4+/CD8+比值为(3.40±0.34),三组与正常小鼠相较,差异均有统计学意义(P<0.05),正常组小鼠淋巴细胞CD4+/CD8+比值为(5.46±1.07)。且术后第七天组小鼠也高于术后前五天组小鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:较正常小鼠,肝原位移植瘤手术对小鼠自发活动水平和肝功能造成损伤,抑制机体淋巴细胞增殖,使CD4+/CD8+比值失调,说明肝原位瘤切除术对小鼠造成了应激损伤,产生了免疫抑制。第二部分:运动对肝原位移植瘤切除术后小鼠淋巴细胞增殖及部分免疫相关通路的影响目的:观察不同运动介入时间和运动强度对原位移植瘤切除术后小鼠淋巴细胞增殖能力的影响及其机制。方法:1、制备肝原位瘤术后小鼠模型,对小鼠在不同运动介入时间进行不同运动强度的干预。2、制备模型小鼠脾淋巴细胞悬液,采用MTT比色法检测运动对模型小鼠淋巴细胞增殖能力的影响。3、采用PathScan?抗体芯片技术进行初筛,蛋白质印迹法(Western Blot,WB)进行验证,探寻运动对肝原位移植瘤切除术后小鼠免疫功能影响的分子机制。结果:1、在术后早期进行中等强度运动干预对小鼠淋巴细胞增殖能力影响不大,为(258.24±0.64)%,与正常小鼠淋巴细胞增殖能力(297.91±0.28)%之间差异无统计学意义,但高强度运动干预在一定程度上抑制了模型小鼠淋巴细胞增殖能力,为(142.03±0.24)%,低于正常小鼠,且差异具有统计学意义(P<0.01)。2、在术后后期进行中等强度运动干预的小鼠淋巴细胞增殖能力为(221.76±0.24)%,与正常小鼠淋巴细胞增殖能力(194.16±0.71)%之间的差异无统计学意义,但高强度运动在一定程度上增强了模型小鼠淋巴细胞增殖能力,为(359.87±0.78)%,高于正常小鼠,且差异具有统计学意义(p<0.01)。3、经过PathScan?抗体芯片技术初筛后发现,运动对肝原位移植瘤切除术后小鼠淋巴细胞的影响主要是通过IL6/JAK2/STAT3和PI3k/AKT/mTOR/STAT3两条通路。经过WB验证后发现术后后期运动可以提高磷酸化STAT3、磷酸化AKT等关键蛋白的表达,对淋巴细胞增殖起正向调节作用。结论:术后早期进行高强度运动对小鼠淋巴细胞增殖能力存在负向调节作用,术后后期进行高强度运动对小鼠淋巴细胞增殖能力有促进作用。运动可能通过IL6/JAK2/STAT3和PI3k/AKT/mTOR/STAT3这两条通路对小鼠淋巴细胞增殖作用产生影响。