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研究背景脂联素是一种脂肪细胞因子,因其在防治心血管疾病、降低肥胖患者体重、降血糖等方面发挥的作用而备受关注。许多研究表明膳食因素可影响脂联素的表达,以脂肪酸的影响最为显著。而脂肪酸根据其碳链长短及其饱和程度不同可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。许多研究表明,不同类型脂肪酸的作用存在差异。另有研究发现在脂联素基因的启动子上存在过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPARγ)的反应元件,PPARγ激动剂通过上调脂联素的表达进而使胰岛素的敏感性增强。研究还发现,高脂饮食可激活细胞周期性蛋白激酶Cdk5 (Cyclin-Dependent Kinase 5),导致PPARγ第273位的丝氨酸磷酸化,进而降低PPARγ对脂联素的特定靶基因的调控,使脂联素表达降低。那么不同类型的脂肪酸对脂联素表达的影响如何呢?作为PPARγ的天然配体的脂肪酸是否能通过PPARγ和(或者)Cdk5-PPARγ途径来调节脂联素表达呢?研究目的本研究拟以体外培养并诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,观察不同浓度、不同类型的脂肪酸对3T3-L1成熟脂肪细胞脂联素分泌和表达的影响,发现脂肪酸调节脂联素表达和分泌的规律；观察在不同脂肪酸及同一脂肪酸不同浓度作用下脂联素与PPARy、Cdk5的关系,为进一步探讨脂肪酸调节脂联素表达的分子机制奠定基础。其研究结果将为肥胖及肥胖相关疾病的防治提供新的思路和科学依据。研究方法1.选用不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的n-3系多不饱和脂肪酸：二十碳五稀酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、α-亚麻酸(a-ALA),n-6系多不饱和脂肪酸：花生四烯酸(AA)、亚油酸(LA),单不饱和脂肪酸：油酸(OA)及饱和脂肪酸：棕榈酸(PA)分别处理体外培养并诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24h,同时设空白对照、阴性对照(GW9662)及阳性对照(rosiglitazone),用实时荧光定量PCR法检测处理后胞内脂联素、PPARy及Cdk5基因表达,观察胞内脂联素、PPARy及Cdk5基因表达变化及脂联素与PPARy、Cdk5的相互关系。2.用100及400μmol/L的EPA、DHA、a-ALA、AA、LA、OA、PA处理3T3-L1成熟脂肪细胞,收集胞内蛋白后,用Western-blot法检测胞内脂联素、PPARy及Cdk5的蛋白质相对表达量,观察受试后各组胞内脂联素、PPARy及Cdk5蛋白的变化。3.用100μmol/L的EPA、DHA、a-ALA、AA、LA、OA、PA处理3T3-L1成熟脂肪细胞后,收集细胞培养液,用Western-blot法检测培养液中脂联素蛋白质相对表达量,观察胞外脂联素蛋白表达的变化。4.所得数据采用平均数±标准差(X±S)表示,采用统计软件SPSS19.0进行分析。如果方差齐,组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA),两两比较采用LSD T-test或dunnett T-test;如果方差不齐,运用Welch法和Dunnett’s T3法分别进行组间比较和两两比较。相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异显著。研究结果1.不同浓度的n-3多不饱和脂肪酸对3T3-L1脂肪细胞胞内脂联素、PPARγ及Cdk5基因表达的影响(1)不同浓度的DHA对脂联素、PPARγ及Cdk5基因表达的影响脂肪细胞经不同浓度的DHA处理后,其25、50、100、200μmol/L浓度组都上调胞内脂联素和PPARy基因相对表达量,差异有统计学意义(P<0.01),其中100μmol/L浓度组对脂联素基因表达的上调作用最为显著。400μmol/L浓度组抑制脂联素及PPARy mRNA表达(P<0.01)；100μmol/L浓度组上调Cdk5基因表达(P<0.05),400μmol/L浓度组下调Cdk5基因相对表达量(P<0.05)。(2)不同浓度的EPA对脂联素、PPARγ及Cdk5基因表达的影响脂肪细胞经不同浓度的EPA处理后,其对脂联素、PPARγ基因相对表达的影响,在25～200μmol/L浓度组均表现为促进作用,其中200μmol/L浓度组对脂联素及PPARγ基因表达的促进作用最为显著(P<0.05);在50～200μmol/L浓度范围可升高Cdk5基因相对表达量(P<0.05)；400μmol/L浓度组抑制脂联素mRNA表达量(P<0.01),此时PPARγ及Cdk5 mRNA相对表达量无显著变化(P>0.05)。(3)不同浓度的α-ALA对脂联素、PPARγ及Cdk5基因表达的影响脂肪细胞经不同浓度的α-ALA处理后,其50、100μmol/L浓度组的脂联素基因相对表达量较对照组显著增加(P<0.05),以100μmol/L浓度组最为明显；浓度为25、50μmol/L时,PPARγ基因相对表达量显著增加(P<0.05);400μmol/L浓度组的脂联素及PPARy基因相对表达量均明显减少(P<0.05)。不同浓度处理组的α-ALA对Cdk5基因相对表达量均无显著影响。2.不同浓度的n-6多不饱和脂肪酸对3T3-L1脂肪细胞胞内脂联素、PPARγ及Cdk5基因表达的影响(1)不同浓度的AA对脂联素、PPARy及Cdk5基因表达的影响脂肪酸细胞经不同浓度的AA处理后,表现为随着浓度的增加,脂联素基因相对表达量逐渐减少。其中25μmol/L浓度组对脂联素基因表达的促进作用显著(P<0.05),400μmol/L浓度组明显抑制脂联素基因表达(P<0.05),其余浓度组较对照组均无差异。PPARy及Cdk5基因相对表达量在50μmol/L浓度组有所升高(P<0.05),随着浓度的增加,PPARy及Cdk5基因相对表达量反而减少,但100、200μmol/L浓度组与对照组相比无显著差异,400μmol/L浓度组的PPARy及Cdk5基因相对表达量明显减少(P<0.05)。(2)不同浓度的LA对脂联素、PPARy及Cdk5基因表达的影响脂肪细胞经不同浓度的LA处理后,脂联素及PPARy基因相对表达量在25-200μmol/L浓度组有所上升,其对脂联素基因表达的促进作用以50μmol/L及100μmol/L组作用较为显著(P<0.05),对PPARy基因表达以200μmol/L浓度组作用较为显著(P<0.05),而脂联素及PPARy基因相对表达量在400μmol/L浓度组均明显减少(P<0.05)；但400μmol/L浓度组的LA对Cdk5基因表达起促进作用,此时Cdk5 mRNA相对表达量较对照组明显增加(P<0.05)。3.不同浓度的单不饱和脂肪酸OA对脂联素、PPARy及Cdk5基因表达的影响脂肪细胞经不同浓度的OA处理后,脂联素及PPARy基因相对表达量在25-100μmol/L浓度组均有所上升,脂联素基因相对表达量在100μmol/L浓度组最高(P<0.01); PPARy基因相对表达量在50、10μmol/L浓度组明显增加(P<0.05)；而100μmol/L浓度组下调脂联素和PPARy基因表达(P<0.05)。高浓度组促进Cdk5基因表达(P<0.05)。4.不同浓度的饱和脂肪酸PA对3T3-L1脂肪细胞胞内脂联素、PPARy及Cdk5基因表达的影响脂肪细胞经不同浓度的PA处理后,脂联素及PPARy基因相对表达量在25-400μmol/L浓度组呈剂量依赖关系,PA的浓度的增加,脂联素及PPARy基因相对表达量反而降低,25μmol/L浓度组的脂联素及PPARy基因相对表达量较对照组有所增加(P<0.05),随后各组的脂联素及PPARy基因相对表达量逐渐减少,400μmol/L浓度组的PA抑制脂联素、PPARy及Cdk5基因表达,且差异有统计学意义(P<0.05),其他浓度组的脂联素、PPARy及Cdk5 mRNA表达较对照组无显著差异。5.不同类型脂肪酸(100及400μmol/L)对3T3-L1脂肪细胞胞内脂联素、PPARy及Cdk5蛋白表达的影响(1)不同类型脂肪酸(100μmol/L)对3T3-L1脂肪细胞胞内脂联素、PPARy及Cdk5蛋白表达的影响用100umol/L的EPA、DHA、a-ALA、LA、AA、OA、PA分别作用于脂肪细胞24h后发现,与对照组相比,EPA、DHA、a-ALA和OA的胞内脂联素蛋白表达显著升高(P<0.05)。AA、LA及PA的胞内脂联素蛋白表达较对照组无明显差异(P>0.05)。统计分析发现,100umol/L的n-3多不饱和脂肪酸较AA、LA、PA更能促进胞内脂联素蛋白的表达,且差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,DHA、ALA、LA的胞内PPARy蛋白表达明显增加(P<0.05),EPA、AA、OA和PA的胞内PPARy蛋白表达无明显差异(P>0.05)。统计分析发现,100μmol/L的n-3多不饱和脂肪酸较n-6多不饱和脂肪酸更能促进胞内的PPARy蛋白的表达(P<0.05)。用100μmol/L各类型脂肪酸处理的胞内Cdk5蛋白表达均与对照组Cdk5蛋白表达无显著差异(P>0.05)。(2)不同类型脂肪酸(400μmol/L)对3T3-L1脂肪细胞胞内脂联素、PPARy及Cdk5蛋白表达的影响用400umol/L的EPA、DHA、a-ALA、LA、AA、OA、PA分别作用于脂肪细胞24h后发现,400μmol/L的各脂肪酸对胞内脂联素蛋白表达均呈现抑制作用,且差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比,高浓度400μmol/L的各脂肪酸对胞内PPARy蛋白表达也呈现抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01)。400μmol/L各类型脂肪酸的胞内Cdk5蛋白表达均与对照组Cdk5蛋白表达无显著差异(P>0.05)。6.不同类型脂肪酸(100μmol/L)对3T3-L1脂肪细胞胞外脂联素蛋白表达的影响用100umol/L的EPA、DHA、a-ALA、LA、AA、OA, PA分别作用于脂肪细胞24h后发现,EPA、DHA、ALA组促进胞外脂联素蛋白表达(P<0.05),AA、LA、OA组对胞外脂联素蛋白表达的调节作用不明显(P>0.05),100umol/L的PA作用下,胞外脂联素蛋白表达量降低,但作用不明显(P>0.05)。统计分析发现,100umol/L的n-3不饱和脂肪酸较AA、LA和PA更能促进胞外脂联素蛋白表达,且差异有统计学意义(P<0.05)。7.胞内脂联素、PPARγ及Cdk5相关性分析对100及400umol/L不同类型的脂肪酸处理后脂肪细胞内脂联素、PPARγ及Cdk5基因表达的相关性进行分析发现,脂联素与PPARγ呈正相关关系(P<0.05), Cdk5与脂联素、PPARγ均无相关关系。对100及400umol/L不同类型的脂肪酸处理后脂肪细胞内脂联素、PPARγ及Cdk5蛋白表达的相关性进行分析发现,脂联素与PPARγ呈正相关关系(P<0.01); Cdk5与脂联素、PPARγ呈负相关关系(P<0.05)结论1.不同浓度的脂肪酸对脂联素表达的影响中以100umol/L组对脂联素的促进作用最明显,400umol/L组对脂联素的抑制作用最明显。2.一定浓度范围内(25-100umol/L),与n-6PUFAs相比,n-3PUFA、单不饱和脂肪酸OA更能促进脂联素的表达,而饱和脂肪酸PA对脂联素的促进作用仅在低浓度25umol/L时起作用。3. n-3PUFAs (DHA、EPA、a-ALA)中,浓度为100umol/L时,以DHA对脂联素的促进作用最强。4. n-6PUFAs (AA、LA)中,AA仅在较低浓度(25umol/L)时促进脂联素表达,而LA在100umol/L时对脂联素表达的促进作用最强。5.不同类型的脂肪酸(100、400umol/L)作用下胞内脂联素基因及蛋白表达与PPARγ基因及蛋白表达呈正相关关系(P<0.05); Cdk5基因表达与脂联素、PPARγ基因表达无相关关系,但Cdk5蛋白表达与脂联素、PPARγ蛋白表达呈负相关关系(P<0.05)。