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研究背景和目的:类风湿关节炎(RA)是自身免疫性疾病的一种，其主要特征为患者四肢存在关节滑膜炎，患者病变部位多发生在外周对称性多关节部位，可使患者身体致畸、致残。其特征是滑膜组织慢性及对称性炎症，其能导致关节破坏、慢性疼痛、损失功能和残疾。 青藤碱(sinomcninc)是从传统中药防己科植物青藤(Sinomenium actum Rehd.)及毛青藤的干燥藤茎清风藤(Caulis sinomenii)中提取的一种生物活性成分，现代药理学研究显示，青藤碱具有良好的抗炎、抗风湿、镇痛和抑制免疫反应的作用，其显著作用表现为能改善患者四肢功能、减少关节晨僵时间及关节疼痛数，但青藤碱免疫抑制和抗风湿的系统作用机理尚阐明。 乌头类中药临床应用广泛，具有抗炎，免疫抑制，强心，止痛，抗肿瘤和降血压等功效，临床上常用来治疗风湿性关节炎，跌打损伤，高血压和肿瘤等各种疾病。但因具有强烈毒性，乌头类中药的临床应用也受到限制。乌头类生物碱是乌头类中药的主要活性成分，同时也是其毒性成分。 前期研究表明，乌头类生物碱能显著上调某些细胞总蛋白和核蛋白中Nrf2的蛋白表达。因此，本研究选取了苯甲酰乌头原碱(BAC)和青藤碱(SIN)，利用大鼠佐剂性关节炎模型和LPS诱导的细胞炎症模型，考察其对佐剂性关节炎的调控及其作用机制。实验结果可为临床上青藤碱治疗类风湿性关节炎提供新的靶点依据，并为乌头类生物碱治疗类风湿性关节炎提供理论依据。 方法: 1.SIN及BAC对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用 1.1 SD大鼠尾根部注射完全弗氏佐剂构建大鼠佐剂性关节炎模型; 1.2足容积测量仪定期测量检测大鼠后足肿胀度; 1.3定期观察评分测定大鼠关节炎指数; 1.4定期称量体重，观察药物对大鼠体重的影响; 1.5使用小动物活体成像仪拍摄大鼠后足X光片，对大鼠踝关节软组织肿胀及骨质破坏评分; 1.6测定大鼠血沉及肝脏、肾脏、脾脏、胸腺的脏器指数; 1.7使用ELISA法检测大鼠血清中炎性因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)的含量; 1.8使用HE染色观察大鼠踝关节病理情况的改变; 1.9使用免疫组化法观察大鼠踝关节中Nrf2蛋白表达的变化; 1.10使用real-time PCR考察大鼠滑膜组织中Nrf2及HO-1，NQO1的表达水平。 2.药物对RAW264.7细胞及FLS细胞的抗炎作用及机制研究 2.1青藤碱的抗炎作用研究。采用小鼠源RAW264.7巨噬细胞，与SIN(100，200，300，400μ M)预孵育1h，加入LPS，使LPS终浓度为100ng/mL，孵育8h后收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测细胞上清中TNF-α，IL-1β及IL-6的分泌量。采用大鼠源滑膜成纤维细胞(FLS)，与SIN(50，100，200，400μ M)预孵育8h，加入LPS，使LPS终浓度为1000ng/mL，孵育48h后收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-1β及IL-6的分泌量。 2.2苯甲酰乌头原碱的抗炎作用研究。采用小鼠源RAW264.7巨噬细胞，与BAC(20，30，40，50μ M)预孵育1h，加入LPS，使LPS终浓度为100ng/mL，孵育8h后收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测细胞上清中TNF-α，IL-1β及IL-6的分泌量。采用大鼠源滑膜成纤维细胞(FLS)，与BAC(20，30，40，50μ M)预孵育8h，加入LPS，使LPS终浓度为1000ng/mL，孵育48h后收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-1β及IL-6的分泌量。 2.3青藤碱及苯甲酰乌头碱抗炎机制研究。细胞收集后，采用Western-blot和real-time PCR考察SIN，BAC对LPS诱导的细胞炎症模型中Nrf2-ARE信号通路Nrf2及其下游HO-1及NQO1蛋白和基因表达水平的影响; 2.4采用稳定转染细胞系，考察SIN、BAC对ARE-荧光素酶报告基因的影响。 结果: 1.药物对佐剂性关节炎的作用及机制 1.1 SIN和BAC能显著改善佐剂性关节炎大鼠后足肿胀度。 1.2 SIN和BAC能显著降低佐剂性关节炎大鼠关节炎指数。 1.3 SIN和BAC对大鼠体重的改变无显著性影响。 1.4 SIN和BAC能显著降低佐剂性关节炎大鼠踝关节软组织肿胀评分及骨质破坏评分。 1.5 SIN和BAC能显著降低佐剂性关节炎大鼠血沉，对大鼠脏器指数无明显影响。 1.6 SIN和BAC能显著降低佐剂性关节炎大鼠血清中TNF-α，IL-1β的含量。 1.7 SIN和BAC能显著改善佐剂性关节炎大鼠踝关节的病理变化，增强Nrf2的蛋白表达量。 1.8 SIN和BAC能显著增强佐剂性关节炎大鼠滑膜组织中Nrf2，HO-1及NQO1的基因表达量。 2.药物对RAW264.7细胞及FLS细胞的抗炎作用及机制研究 2.1 SIN和BAC对HepG2-C8细胞、RAW264.7及FLS细胞活性无显著影响。 2.2在RAW264.7及FLS细胞中，SIN和BAC均能显著降低LPS诱导的细胞炎性因子(IL-1β，IL-6)增长趋势。 2.3在RAW264.7和FLS细胞中， SIN和BAC可显著上调细胞总蛋白中Nrf2的蛋白表达，且能上调Nrf2下游靶基因NQO1和HO-1的蛋白表达。同时，在HepG2-C8细胞中，SIN和BAC可浓度和时间依赖性激活ARE荧光素酶活性，表明SIN和BAC可增强Nrf2与ARE结合而激活Nrf2通路，从而上调HO-1及NQO1的表达。 结论:青藤碱和苯甲酰乌头原碱可以显著改善佐剂性关节炎大鼠症状，对关节炎大鼠踝关节及滑膜中Nrf2、HO-1、NQO1的表达有显著上调作用。青藤碱和苯甲酰乌头原碱可以显著降低RAW264.7和FLS细胞中，LPS诱导的炎性细胞因子上升趋势，且能上调细胞中Nrf2、HO-1，NQO1的蛋白及基因表达。说明Nrf2-ARE信号通路可能介导SIN及BAC对类风湿性关节炎的治疗作用。