【摘 要】
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目的： 构建pBud-Iprl-PPE68-OriM穿梭质粒，观察鼠胞内抗性基因1(intracellular pathogen resistance1，Ipr1)和PPE68基因在鼠巨噬细胞株RAW264.7内的表达。并将Ipr1/PPE68 DNA
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目的： 构建pBud-Iprl-PPE68-OriM穿梭质粒，观察鼠胞内抗性基因1(intracellular pathogen resistance1，Ipr1)和PPE68基因在鼠巨噬细胞株RAW264.7内的表达。并将Ipr1/PPE68 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，探讨其诱导体内免疫应答的情况。 方法： 1、Ipr1基因、PPE68抗原编码序列分别插入pBudCE4.1质粒的多克隆位点，经酶切测序鉴定后，构建pBud68-Ipr1质粒，将其转染入巨噬细胞株RAW264.7，通过RT-PCR Western Blot检测Ipr1和PPE68蛋白的表达。结核分枝杆菌的复制子(Mycobacterium tuberculosisorigin of replication，OriM)的编码序列分别插入到pBud68-Ipr1质粒的Nhe1位点，构建pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭质粒。 2、pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭质粒免疫BALB/c小鼠，在末次免疫后2周，ELISA法检测小鼠体内的lgG2a、IL-12以及IFN-γ的表达水平，MTT法检测脾淋巴细胞增殖的情况，流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞的数量，同时通过病理切片观察BALB/c小鼠肺脾组织的病理变化。 结果： 1、经过酶切测序鉴定pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭质粒构建成功，RT-PCR、Western-Blotting鉴定Ipr1和PPE68蛋白在巨噬细胞株RAW264.7表达成功。 2、pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭质粒免疫后的BALB/c小鼠血清内的lgG2a、IL-12、IFN-γ以及CD4+和CD8+T细胞数量都表现出了有意义的提高。脾淋巴细胞的增殖水平与BCG相比没有区别。肺脾组织均未观察到病理学变化。 结论： 1、成功构建了pBud-Ipr1-PPE68-OriM穿梭质粒，转染后的巨噬细胞株RAW264.7能够表达Ipr1和PPE68蛋白。 2、该疫苗能够有效诱导BALB/c小鼠Th1型免疫反应，为下一步研究其抗结核分枝杆菌感染的免疫保护作用奠定基础。
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