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微卫星(microsatellite,MS)是指一类不编码的,数量可变的,广泛存在于原核及真核基因组中,具有高度多态性,简单串联式的核苷酸重复序列。MS由2～6个核苷酸组成,多位于基因编码区附近,也可位于内含子和启动子中,遵循孟德尔遗传规律,呈遗传稳定性。MS通过改变DNA结构和与特异性蛋白结合发挥基因调控作用,是基因重排和变异的来源。
微卫星DNA序列不稳定性(Microsatellite Instability,MSI)是指由DNA复制错误(Replication Errors,RER)引起的简单重复序列的改变,表现为肿瘤组织与其相应的非肿瘤组织DNA结构性等位基因的大小发生改变。MSI最早在1993年发现于遗传性非息肉性结肠癌(HereditaryNonpolyposis Colorectal Cancer,HNPCC),后又陆续在胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、小细胞肺癌等肿瘤中发现。迄今为止,几乎每一类型的肿瘤都已被证明有MSI的存在。
产生MSI的主要原因是错配修复(Mismatch Repair MMR)功能缺陷,不能正常地发挥错配修复作用。MMR缺陷所致的MSI通过DNA的复制和细胞分裂而被保存在基因组中,增加了其他基因的不稳定性,进而出现整个基因组的不稳定性,导致细胞增殖及分化异常,从而促进肿瘤的发生。
某等位基因的基因型由杂合状态变为半合性(Hemizygosity)、纯合性(Homozygosity)、或零和性(Nulizygosity)称为杂合子丢失(Loss ofHeterozygosity,LOH)。绝大多数人类肿瘤都存在非随机性的染色体片段缺失。染色体上特异性等位基因丢失,是人类肿瘤基因组中常见的遗传学改变。MS多态位点与抑癌基因紧密连锁,根据Knudson的“两次打击”学说,若在染色体某一位点处频发LOH,则此位点附近可能存在抑癌基因。探讨LOH现象,有助于研究肿瘤发生发展过程中的隐性遗传变化及其机制。
肿瘤的微转移是指恶性肿瘤在发展过程中,肿瘤细胞播散并存活于血循环、淋巴管、骨髓及各组织器官中,未形成转移结节,无任何临床表现,常规检查方法如影像、病理等难以发现。多数学者以2mm作为微转移灶的上限。1993年国际抗癌联盟(UICC)在肿瘤TNM分期补充材料中指出:当微小肿瘤转移灶生长到直径在1～2mm时称为微转移。传统的病理学检查对确定肿瘤微小转移灶的作用有限。早期发现肿瘤患者淋巴结中的微转移对肿瘤转移和复发的判断以及对指导临床综合治疗均具有重要价值。随着对胃癌微转移的深入研究,在分子水平上诊断胃癌淋巴结微转移已成为可能。
细胞角蛋白(CK)是一种中间丝蛋白,是构成细胞骨架的必要成分。它不表达于正常淋巴结中,并且CK亚型的表达有助于区分原发肿瘤和转移癌,是检测淋巴结微转移的常用指标。细胞角蛋白18(CK18)主要标记各种单层上皮。检测CK18在胃癌中的表达,目前在文献中报道较少。
本研究以胃癌组织和区域淋巴结为研究对象,采用PCR、RT-PCR和免疫组化等方法,检测其中CK18及D2S123、D3S1577、D7S520、D9S257、D18S58和hMLH1、hMSH2等的表达,研究微转移和微卫星等因素在胃癌的发生和淋巴结转移中的作用,探讨胃癌发生发展的分子生物学基础,旨在对胃癌淋巴结转移的预防、治疗和判断预后提供实验依据。
第一部分胃癌及区域淋巴结微卫星DNA序列不稳定性的研究
目的:研究微卫星DNA序列不稳定性和胃癌及区域淋巴结之间的联系,开辟胃癌的诊断、治疗及病情判断等问题上新的认识途径。
方法:应用PCR方法,检测胃癌组织及区域淋巴结中D2S123、D3S1577、D7S520、D9S257及D18S58 DNA的表达水平,并分析其与胃癌临床生物学行为的关系。
结论:
1 D2S123、D3S1577、D7S520、D9S257和D18S58五个基因位点中均发生MSI,其中D9S257位点MSI的发生率最高。同时,MSI阳性组织中,D9S257位点MSI-H的发生率同样最高。可见,D9S257是MSI活跃的位点。
2 MSI与患者性别、年龄、胃癌的细胞分化程度、组织类型、Lauren分型等方面无统计学差异。
3在直径＜5cm、T1+T2期、Ⅰ～Ⅱ胃癌中MSI的阳性率较高。可见,MSI阳性多发生在较小的肿瘤体积,较浅的肿瘤浸润和较早的肿瘤分期中。
4各位点区域淋巴结中MSI的阳性率无明显差异。
第二部分胃癌及区域淋巴结中CK18 mRNA表达的研究
目的:研究胃癌组织及区域淋巴结中CK18 mRNA表达与胃癌微转移的关系。
方法:选取行胃癌根治术的病人,应用RT-PCR方法,检测胃癌组织、无转移淋巴结组织中CK18 mRNA的表达,并分析其与胃癌临床生物学行为的关系。
结论:
1常规病理检查阴性的淋巴结中,CK18 mRNA表达阳性,提示存在胃癌淋巴结微转移。
2 CK18 mRNA多在胃腺癌及其区域淋巴结中表达。
3淋巴结中表达CK18 mRNA的胃癌,其肿瘤大小较大,浸润程度较深,病程进展较晚,易发生肿瘤的转移。
4检测CK18 mRNA,对胃癌淋巴结微转移的检测具有一定的诊断价值。
5常规病理检查阴性处于PN0期的淋巴结,经RT-PCR法检出CK.18 mRNA表达,提示应属PN1期。可见,胃癌淋巴结微转移的研究将有助于更准确地掌握淋巴结转移规律,更为科学地进行临床分期。
6 RT-PCR方法对CK18 mRNA的检测具有较高的敏感性和特异性,具有良好的应用前景。
第三部分胃癌及区域淋巴结hMLH1、hMSH2及CK18蛋白表达的研究
目的:检测胃癌及区域淋巴结中hMLH1和hMSH2及CK18蛋白表达,比较其检测结果,并统计其5年生存率,为胃癌的预防和治疗提供实验依据。
方法:应用免疫组化技术,检测胃癌及区域淋巴结中hMLH1和hMSH2及CK18蛋白表达,并比较其预后。
结论:
1胃腺癌中hMSH2,区域淋巴结中hMLH1和hMSH2蛋白表达的阳性率高于其他病理类型,提示hMLH1和hMSH2蛋白表达与腺癌关系密切;
2在浸润较浅肿瘤及淋巴结中,hMLH1、hMSH2蛋白表达丰富,说明MSI与较浅的肿瘤浸润相关。
3 CK18蛋白多在腺癌及其淋巴结中表达;在T3+T4期胃癌及淋巴结中,CK18蛋白表达较高,说明CK18蛋白多表达在浸润较深胃癌及淋巴结中;
4胃癌MSI、CK18的表达具有一致性。联合检测二者的蛋白表达,对胃癌的诊断具有一定的意义;
5 MSI阳性的胃癌患者,其生存期延长,预后好于MSI阴性的患者;
6 CK18表达阴性的胃癌患者,患者生存期延长,其预后明显好于CK18阳性的患者;
7 hMLH1、hMSH2和CK18蛋白在原发癌和区域淋巴结中的表达是一致的。