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三七是传统活血止血中药,其主要活性成分是三七总皂苷(PNS)。目前PNS已被广泛运用于治疗心血管疾病,尤其对于抗血小板药物抵抗、继发性硝酸甘油失效及术后仍胸闷胸痛等难治性冠心病血瘀证患者疗效突出。但由于PNS包含数十种皂苷成分,作用靶点繁多,作用环节交错,作用机制复杂,在一定程度上限制了其临床运用和疗效发挥。而现有PNS治疗冠心病血瘀证的机制研究结果分散、单一,难以形成清晰、系统的调控网络。有鉴于此,本研究利用网络药理学预测、临床验证和细胞学基础研究的方法,旨在从转录组学层面系统揭示PNS治疗冠心病血瘀证的多靶点、多层次网络作用机制,以期为PNS的临床运用提供客观依据,从而提高中医药治疗冠心病的临床疗效。目的从lncRNA-miRNA-mRNA调控网络层面,利用网络药理预测、临床验证和细胞学功能研究,系统揭示PNS治疗冠心病血瘀证的多靶点、多层次整体作用机制。方法第一部分 基于网络药理学的PNS治疗冠心病血瘀证靶基因及IncRNA-miRNA-mRNA调控网络的预测研究根据2015版《中华人民共和国药典》确定PNS的5个主要成分为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd。首先,运用PharmMapper数据库,通过反向药效团匹配的方法,分别预测与5种成分中每种匹配度最高的前300个靶基因,将靶基因统一命名并作去重处理。同时,在NCBI GEO数据库中检索和筛选人类冠心病靶基因相关研究,利用GEO2R分析GSE20686基因集中393例冠心病和非冠心病患者的差异表达基因,筛选其中差异倍数至少为1.5且P<0.05者作为冠心病的靶基因。基于团队前期高通量测序数据,分析15例冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和健康人群的差异表达基因(每组各5例),从而获得冠心病血瘀证的靶基因。其次,通过对PNS、冠心病及冠心病血瘀证的预测靶基因进行统一命名后,采用VENN网站分析3组数据的交集基因,并利用GeneCards、GeneMANIA及WebGestalt GSAT数据库分析该交集靶基因及其共表达网络的GO功能及KEGG通路。最后,根据交集靶基因的功能及信号通路,结合本团队前期构建的冠心病血瘀证lncRNA-miRNA-mRNA网络,进一步预测PNS治疗冠心病血瘀证的调控网络。第二部分PNS干预冠心病血瘀证靶基因及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的临床验证研究采用临床随机双盲安慰剂对照试验,纳入冠心病不稳定型心绞痛(UA)血瘀证患者80例,随机分为试验组和对照组各40例。试验组为西医基础治疗+血塞通软胶囊(主要成分是PNS,以下简称PNS),对照组为西医基础治疗+PNS模拟剂,疗程为4周。分别观察两组的性别、年龄、吸烟、饮酒、体重指数、危险因素、用药情况和血运重建情况等基线指标,以评价组间均衡性。比较两组的主要疗效和次要疗效指标,以评价PNS治疗UA血瘀证的临床有效性。主要指标为心绞痛疗效和中医证候疗效,通过分析西雅图心绞痛量表(以下简称西雅图量表)和冠心病心绞痛血瘀证疗效评价量表(以下简称血瘀证量表)的积分变化获得。次要指标为中医症状体征疗效,通过分析两组治疗前后的症状体征变化获得。同时,统计两组治疗前后的血常规、肝肾功能、血糖、血脂、心肌酶、凝血功能及心电图等安全性指标,评价PNS的临床安全性。为了验证PNS治疗冠心病血瘀证的靶基因及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进一步采用实时荧光定量PCR检测两组治疗前后血浆中靶基因及网络的表达水平,分别计算2-ΔΔCt值及差异倍数。第三部分基于RNA干扰技术研究PNS调控lncRNA-miRNA-mRNA网络的作用机制采用H2O2干预人脐静脉内皮细胞以构建冠心病血管内皮细胞氧化应激损伤模型。利用化学合成siRNA的方法制备miR-3656 inhibitor和miR-3656 mimics,并以慢病毒shRNA包装的方法制备lncR CTB-114C7.4 overexpression和lncR CTB-114C7.4 knockdown。运用噻唑蓝比色法分别筛选H2O2的造模浓度,以及PNS的最佳干预时间和浓度。完成以上前期实验基础后,将实验分为7组:空白对照组、H2O2 模型组、H2O2+PNS 治疗组、H2O2+lncR CTB-114C7.4 overexpression组、H2O2+miR-3656 inhibitor 组、H2O2+PNS+lncR CTB-114C7.4 knockdown 组、H2O2+PNS+miR-3656 mimics组。利用实时荧光定量PCR检测网络中各RNA的表达量,分别将H2O2模型组与空白对照组、PNS治疗组,以及H2O2基础上的RNA干扰组进行两两比较;同时,将PNS治疗组与PNS基础上的RNA干扰组亦进行比较,通过计算2-ΔΔCt值及差异倍数,从而分析PNS调控网络的启动靶点和确切调控模式。同时,运用蛋白质印迹法检测各组中BCL2A1和Beclin1蛋白的表达水平,计算灰度比值,比较不同分组之间蛋白含量的差异,观察是否与相应mRNA表达保持一致。进一步运用流式细胞仪和透射电子显微镜,结合在溶酶体抑制剂条件下LC3-II蛋白水平的变化,以测定不同实验分组的细胞凋亡、自噬小体和自噬流情况,从而分析该调控网络对细胞凋亡和细胞自噬的影响。结果第一部分 基于网络药理学的PNS治疗冠心病血瘀证靶基因及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的预测研究1、由PharmMapper数据库预测到656个PNS靶基因,在GSE20686基因集中分析出225个冠心病的靶基因,经团队前期高通量测序获得221个冠心病血瘀证的靶基因;2、以上3类预测靶基因有一个共同的交集是BCL2A1。该靶基因具有调节蛋白质结合的功能,与细胞凋亡和细胞自噬信号通路密切相关;3、BCL2A1 可以作为NR4A1 的下游调节因子,共同参与lncR CTB114C7.4-miR3656-NR4A1调控网络介导的细胞凋亡信号通路。因此BCL2A1 可能为 lncR CTB114C7.4-miR3656 的下游靶基因;4、BCL2A1蛋白还能与Beclin1蛋白结合,影响后者的生物学功能,进而调节细胞自噬。以上网络预测结果表明,PNS可能通过lncRCTB114C7.4-miR3656-BCL2A1/Beclin1网络,调节细胞凋亡或细胞自噬,进而发挥治疗冠心病血瘀证的作用。第二部分PNS干预冠心病血瘀证靶基因及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络的临床验证研究1、试验组和对照组的各项基线指标无统计学差异,表明两组具有可比性;2、在心绞痛疗效方面,PNS能降低心绞痛发作次数、改善心绞痛稳定状态;3、在硝酸甘油停减率方面,PNS能减少硝酸甘油的使用量;4、在中医证候疗效方面,PNS能降低患者的血瘀证积分,将血瘀证量表的平均减分率从6.63%提高到34.44%;5、在单项中医症状体征疗效方面,PNS能明显改善患者胸痛和胸闷症状,治疗有效率分别为80.65%和76.32%;6、在安全性指标方面,PNS对患者血常规、肾功能、凝血功能及心电图等无影响,并能改善血糖和部分肝功能、血脂及心肌酶指标,表明其临床运用安全;7、在靶基因及调控网络方面,PNS能上调患者血浆中lncR CTB-114C7.4和BCL2A1表达,并下调miR-3656和Beclin1表达水平。以上临床试验结果证实了 PNS治疗冠心病血瘀证的有效性和安全性,并验证了 PNS对预测靶基因及网络的干预作用,同时提示网络的调控模式可能为lncR CTB114C7.4↑-miR3656 ↓-BCL2A1 T/Beclin1 ↓。第三部分基于RNA干扰技术研究PNS调控lncRNA-miRNA-mRNA网络的作用机制1、lncR CTB-114C7.4是PNS的直接作用靶点,也是网络中的上游启动靶点;2、PNS调控网络的确切模式为lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1↑,而Beclin1 mRNA则表现不稳定,不直接参与该网络;3、BCL2A1蛋白在各组中的相对表达水平与其mRNA表达量保持一致,表明PNS能通过激活网络促进BCL2A1蛋白表达。而Beclin1蛋白则与BCL2A1蛋白在各组中保持相对固定的负相关关系,表明二者存在相互作用;4、在细胞凋亡方面,H2O2模型组能促进细胞凋亡,以早期细胞凋亡为主;PNS治疗组、lncR CTB-114C7.4过表达组和miR-3656阻滞组均能抑制早期和总细胞凋亡;lncR CTB-114C7.4敲降组和miR-3656过表达组则能逆转PNS的抗早期及总细胞凋亡作用。该结果表明,PNS能通过激活lncR CTB114C7.4k↑-miR3656↓-BCL2A1↑网络,从而抑制早期细胞凋亡;5、在细胞自噬方面,H2O2模型组能促进自噬小体形成和自噬相关膜合成,并有增加自噬流的趋势;PNS治疗组和lncR CTB-114C7.4过表达组均能减少自噬相关膜合成,抑制自噬小体形成和自噬流;lncR CTB-114C7.4敲降组则促进自噬小体形成,能重新激活细胞自噬。以上细胞实验表明,PNS能通过上调lncR CTB-114C7.4表达,激活lncR CTB114C7.4↑-miR3656↓-BCL2A1T网络,影响 BCL2A1 和 Beclin1 蛋白水平,从而抑制血管内皮细胞凋亡和细胞自噬。结论1、研究表明PNS治疗冠心病血瘀证的预测靶基因是BCL2A1,调控网络是lncR CTB114C7.4-miR3656-BCL2A1/Beclin1;2、PNS 治疗冠心病血瘀证有效,在临床有效的基础上进一步验证了其对靶基因及网络具有调控作用;3、PNS调控网络的启动靶点是lncR CTB-114C7.4,确切调控模式是lncR CTB114C7.4↑-miR3656 ↓-BCL2A1↓,介导的细胞学功能是通过上调BCL2A1蛋白,并下调Beclin1蛋白表达,抑制血管内皮细胞凋亡和细胞自噬,从而发挥治疗冠心病血瘀证的作用。