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传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是指由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)感染禽法氏囊(Bursa of Fabricius,BF)而引起的一种急性、接触性的传染病,其主要以侵害未成年家禽免疫器官(法氏囊)为特征。目前,IBD在世界范围内分布广泛,其给养殖业带来的危害主要体现为IBDV感染鸡群后导致鸡群死亡所带来的直接经济损失和发病鸡群产肉、产蛋等生产性能下降带来的间接经济损失。传统的IBD灭活苗和活疫苗免疫动物后产生的抗体对IBD经典毒株的感染具有很好的预防作用,但是,其在生产或使用过程中有散毒的危险,且不能预防法氏囊病毒超强毒株(Very viru1ent infectious bursa1 disease virus,vvIBDV)和变异毒株对禽类的感染。因此,我们将通过探索以下三种基因工程生物制品的研究,旨在(1)通过给鸡群注射IBD基因工程疫苗使其产生抵抗IBDV的抗体,预防IBD的发生,减少因使用传统的IBD活疫苗导致的疫苗毒的散播;(2)使用具有免疫佐剂效应的基因工程杂合肽囊素,来增加商品化IBD疫苗免疫后鸡群产生抗体的效价和提高鸡群抵御IBD感染的能力;(3)把具有抗病毒活性的重组鸡β干扰素应用于鸡群,借以增强鸡群抵抗IBDV在其体内的繁殖能力。具体内容如下:1.IBD基因工程疫苗的研究(1)mVP2疫苗抗原的研究目前关于IBD基因工程疫苗相关的研究比较多,我们设计了IBDVmVP2序列(在鸡vvIBDVVP2基因的5’端和3’端各添加了一个IBDVVP2蛋白的中和性B细胞抗原表位核酸序列)。我们首先选择在巴士德毕赤氏酵母中表达mVP2的核酸序列,实验结果表明酵母系统实现了对mVP2序列的表达和翻译后的糖基化修饰。但是,由于mVP2在酵母中表达水平比较低(约0.06mg/ml),不符合禽用产品成本低的要求,因此,我们又探索利用大肠杆菌系统来表达mVP2的核酸序列。实验结果表明,其在大肠杆菌的表达量可占总蛋白的8%左右,这比在酵母中的表达水平提高了近20倍。免疫琼扩实验结果表明重组大肠杆菌mVP2蛋白的琼扩效价可以达到1:16,这说明大肠杆菌表达的mVP2具有较好的体外免疫学活性。以mVP2为疫苗抗原制备的基因工程IBD疫苗免疫SPF鸡群,实验结果表明:免疫后鸡群中,有一部分鸡只产生了抗体,用标准鸡法氏囊强毒BC6/85毒株攻毒后,各免疫组鸡群法氏囊细胞坏死的情况和淋巴小结完整性等情况均比阳性对照组鸡群法氏囊的病理分析结果要好。但是,各免疫组与阴性对照组相比,其淋巴小结出现结构不完整,皮质和髓质界限模糊的病理特点,这说明以mVP2为疫苗抗原制备的基因工程IBD疫苗的免疫效果欠佳。我们尝试了使用基因工程杂合肽囊素和基因工程鸡β干扰素等来提高其免疫效果。实验结果显示:虽然产生抗体的鸡群比例有所提高,但其并不能完全保护法氏囊免受IBDV感染。因此,我们需要在以后的研究中进一步提高mVP2的免疫性能。(2)IBDVSOE多表位肽疫苗抗原的研究目前已经有许多研究报道人工合成的多肽疫苗和基因工程表达的肽疫苗可以成功地诱导动物机体产生抗体。本研究通过SOE PCR的方法把4个IBDV的抗原表位串联之后,获得了 IBDVSOE多表位肽的核酸序列,其在大肠杆菌的表达量占总蛋白的18%左右。体外免疫学实验证实:大肠杆菌表达的IBDV SOE多表位肽的琼扩实验效价高达1:32,这说明其具有很高的体外免疫学活性。但动物实验证实其作为疫苗抗原免疫效果比较低,我们试图从改变佐剂的种类和使用免疫增强剂及抗病毒细胞因子等各方面来提高其体内免疫效果,虽然免疫后鸡群的抗体效价从1:2提高至1:4,但攻毒后鸡群法氏囊的病理损伤仍然比较明显。因此,如果要把IBDVSOE制备成为具有理想免疫效果的疫苗,这还需要以后的实验进一步探索。不过,由于IBDV SOE具有很好的体外免疫反应性(比标准IBD琼扩抗原的效价高16倍),所以,其具有作为鸡法氏囊琼扩检测抗原的潜力。2.免疫增强剂--基因工程杂合肽囊素的研制研究表明天然的囊素三肽(Lys-His-Gly-NH2)和B淋巴四肽(Lys-Asn-Pro-Tyr)刺激物均具有诱导B淋巴细胞的分化,提高机体免疫能力,增强疫苗免疫效果的能力。因此,在前人研究的基础上,本实验合成了 14个囊素三肽的重复序列和2个四肽序列的串联物,形成了杂合肽囊素的核酸序列,并在大肠杆菌系统中进行表达,期望表达的基因工程杂合肽囊素能提高商品化疫苗的免疫效果。实验结果显示:杂合肽囊素的核酸序列在大肠杆菌中的表达量占总蛋白量的20%,之后我们纯化了基因工程杂合肽囊素,并分析了其在体外刺激B淋巴细胞增殖能力。我们发现0.9mg/ml的基因工程杂合肽囊素能很好地诱导鸡外周血B淋巴细胞的分化,这初步说明其具有理想的体外免疫学活性。SPF级动物实验结果表明:基因工程囊素可以明显增加商品化鸡法氏囊灭活疫苗4倍的抗体效价(从1:4增加至1:16)。对实验组鸡群法氏囊的病理切片分析结果显示:基因工程囊素可以明显改善大剂量IBDV感染后商品化鸡IBD疫苗免疫后鸡群法氏囊的病理变化。因此,我们可以初步确定,基因工程杂合肽囊素是一种具有免疫佐剂功能的免疫增强剂。3.免疫增强剂--基因工程鸡β干扰素的研制β干扰素是一种具有广谱抗病毒能力和调节机体免疫力的免疫增强剂,但用人工提取的方法成本太高,因此,目前基本都是采用基因工程的方法进行制备。为了增加鸡群抵抗IBD等病毒性疾病的能力,我们探索了在体外制备基因工程鸡β干扰素的方法。首先,我们以鸡肝全基因组为模板,扩增了鸡β干扰素成熟蛋白基因,并在大肠杆菌体系中实现了鸡β干扰素的较高表达(总蛋白量18%)。细胞病变抑制实验结果表明:大肠杆菌表达的鸡β干扰素(蛋白浓度为0.25mg/ml)在44倍稀释后能较好地抑制100TCID50水泡性口炎病毒繁殖,同时其在65倍稀释后能有效抑制100TCID50鸡传染性法氏囊病毒(HN3)株的复制。SPF鸡群动物实验结果显示:重组鸡β干扰素协同商品化IBD疫苗免疫后能完全保护鸡群免受大剂量(1000EID)IBDV 的感染。总之,本研究制备的mVP2蛋白和IBDV SOE的多表位肽具有很好的体外免疫学活性,因此,它们具有作为IBD琼扩检测抗原的潜力,但若将它们作为疫苗抗原,还需要进一步探索提高其免疫效果的方法。不过令人欣喜的是,本研究成功地研制出两种基因工程免疫增强剂:基因工程杂合肽囊素(具有免疫佐剂功能)和基因工程鸡β干扰素(具有增加抗病毒的免疫功能),体外免疫学实验和动物体内实验结果均证实它们都是很好的免疫增强剂,具有很好的应用价值。