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哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显著增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显著升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显著增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。