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小分子药物在细胞内常常与多个靶标同时作用。一方面，“脱靶”效应可能会导致毒副作用，另一方面这也为发现旧药物的新用途提供了机会。近年来，多重药理学(polypharmacology)已经取代了原来的“一个基因，一种疾病，一种药物”的观念，成为新药研发的新模式。鉴定小分子药物在体内的靶标蛋白谱是多重药理学研究和新药发现的关键一环。但是，小分子药物靶标的鉴定工作是一件令人生畏的挑战性的工作。直到目前为止，仍没有通用、可靠的小分子药物靶标的鉴定方法。因此，发展可普遍适用的药物靶标蛋白鉴定技术对于化学生物学研究和新药物研发都具有重要的意义。 本论文的目的是发展基于亲和整体柱技术的靶标蛋白的分离纯化新技术，建立一个研究生物活性小分子化合物和小分子药物的靶标谱的技术平台。在此基础上通过大环内酯类免疫抑制剂在细胞内的靶标蛋白谱的鉴定和分析，阐述它们的多重药理学性质。 在第一章，我们对近十年来鉴定小分子药物和生物活性化合物的靶标蛋白的技术，特别是近年来化学蛋白组学的进展做了总结和评述。 第二章尝试了两步法制备毛细管亲和整体柱的方法，用于大环内酯类免疫抑制剂FK506的靶标富集。采用甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯在致孔剂存在下在毛细管柱中共聚，构筑了具有双孔结构的整体柱床。然后将活化好的FK506通过乙二胺固定在整体柱骨架上制备得亲和整体柱。将该亲和整体柱用于从Jurkat T细胞裂解液中富集靶标蛋白，经质谱鉴定后确定富集的蛋白即FK506的已知靶标蛋白FKBP12。该整体柱的制备方法简单。但是由于毛细管内体积的限制，使得在毛细管柱中小分子配体的固定化过程很难控制，亲和柱的重现性不好，影响了靶标蛋白的富集效率。 在第三章中，为了克服两步法制备的亲和整体柱缺陷，我们建立了一种“一锅”法制备亲和整体柱用于小分子药物的靶标鉴定。利用该方法鉴定FK506，环孢素A靶标蛋白谱。将这两种免疫抑制剂经化学修饰使其末端连接双键，这种药物的衍生物作为功能单体参与聚合，进而一步制备亲和整体柱。这种制备亲和整体柱的方法制备过程简单，可以准确控制小分子药物的固载量，重复性较好，且富集蛋白效率较高。我们对亲和柱的色谱性能进行了评价。利用该方法，我们共鉴定33种FK506的结合蛋白，32种环孢素A的结合蛋白，其中包括这两种药物已知的靶标蛋白。这一结果说明，亲和整体柱技术可以高效的富集小分子药物的靶标蛋白谱。 在第四章中，基于第三章亲和整体柱富集靶标蛋白的结果，我们首先通过考察富集的结合蛋白与亲和整体柱的相互作用，验证线粒体丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PGAM5是环孢素A，FK506的结合蛋白。结合液相色谱质谱联用和毛细管电泳激光诱导荧光分析的生化测试方法，定量考察环孢素A，FK506及雷帕霉素对PGAM5活性的抑制。细胞活性测试以及RNAi实验验证了PGAM5是免疫抑制剂环孢素A，FK506及雷帕霉素的靶标蛋白，这一结果实现了小分子化合物对细胞坏死的调控，也为发现与细胞坏死相关疾病如心肌梗死，中风等疾病的治疗药物提供了依据。