【摘 要】
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为了探索日本血吸虫基因组内"特异的"重复序列及其在检测日本血吸虫感染的钉螺及水样中的应用,该研究应用聚合酶链反应(PCR)及基因克隆的方法,克隆并分析了日本血吸虫基因组
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为了探索日本血吸虫基因组内"特异的"重复序列及其在检测日本血吸虫感染的钉螺及水样中的应用,该研究应用聚合酶链反应(PCR)及基因克隆的方法,克隆并分析了日本血吸虫基因组内的一个串联重复序列,并据此建立了用于检测日本血吸虫感染的PCR方法,初步探索了其应用于现场的可能性,结果如下:1.根据曼氏血吸虫基因组"特异的"重复序列Sml-7设计合成PCR引物,以日本血吸虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增.2.根据埃及血吸虫基因组"特异的"重复序列The Dra I repeat设计合成PCR引物,以日本血吸虫基因组DNA作为模板,进行PCR扩增.3.将根据Sml-7设计合成的引物引导的PCR反应的扩增产物中350bp的条带回收、纯化后,克隆入载体pUCm-T中,转化宿主菌JM109,在含Amp/IPTG/X-gal的LB平板上培养,重组克隆制备质粒DNA,经Pst I酶切鉴定,挑选6个可能含有的基因的重组克隆进行DNA序列测定及分析.4.构建日本血吸虫部分基因组文库,随机挑选重组克隆进行Pst I和EcoR I双酶切分析,选取含有的插入片段含量及出现频率均相对较高的重组克隆,进行DNA序列测定,获得一个大小为127bp的串联重复序列pSj207,约占整个日本血吸虫基因组的1﹪.5.序列分析结果表明,pSj207中G+C的含量为40﹪,A+T/G+C的比值为1.5,仅有一个Sau3A酶切位点,与Sml-7序列及The Dra I repeat相似.此外,该序列中尚存在2-4bp的直接或间接重复.6.序列pSj207的同源性分析显示,它与GenBank中已注册的日本血吸虫基因组18S核糖体RNA基因的部分序列有79bp是相同的,与马来血吸虫的18S核糖体RNA基因的部分序列有76bp是相同的,与湄公血吸虫的18S核糖体RNA基因的部分序列有75bp是相同的.由于其同源性比对所获最大score为76,根据P.Brindley提出的Score<200为新基因序列的标准,可判断序列pSj207为一新的DNA序列.7.根据得到的新序列pSj207设计合成PCR引物,以自备的12种缓冲液进行PCR扩增,建立了实验室检测日本血吸虫感染的PCR方法.实验室内分析该方法的灵敏性,结果显示该方法能够检测到约0.1pg日本血吸虫基因组DNA及水样中含有的5条尾蚴.此外,该方法也能够检测阳性钉螺特别是处于感染早期的钉螺.
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