斜带石斑鱼芳香化酶P450基因启动子克隆与分析

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芳香化酶基因属于细胞色素P450基因家族。它所编码的芳香化酶是催化雄激素转化雌激素反应的关键酶。在斜带石斑鱼中,本实验室前期工作表明存在卵巢芳香化酶(CYP19a)基因和脑芳香化酶(CYP19b)基因。卵巢芳香化酶基因主要在性腺中表达,而脑芳香化酶基因则主要在脑组织中表达。这两种芳香化酶可能都参与了斜带石斑鱼性逆转过程的调节。 本文利用GenomeWalkerPCR和基因组PCR的方法,成功地克隆得到斜带石斑鱼卵巢芳香化酶(CYP19a)基因和脑芳香化酶(CYP19b)基因5旁侧序列及其基因全长。斜带石斑鱼CYP19a基因全长约3.3kb,包含9个外显子和8个内含子,内含子都具有保守的GT/AG边界特征。斜带石斑鱼CYP19b基因全长约8kb,包含10个外显子和9个内含子。与CYP19a基因内含子不同的是,CYP19b基因中含有1个边界为GC/AG的稀有内含子,并且包含有3个约为2kb的大内含子,其中1个还存在于5UTR中。 我们通过英特网上的转录元件搜索系统(TESS),分别对所获得的斜带石斑鱼CYP19a基因5旁侧区和CYP19b基因5旁侧区各约2.6kb和2.5kb序列作了分析。在斜带石斑鱼CYP19a基因转录起始位点上游-28nt存在一个TATA框,在-117nt和-145nt处存在两个卵巢芳香化酶特有的FTZ-F1结合位点,它们可能对斜带石斑鱼CYP19a基因在卵巢中的特异性表达起着非常重要的作用。在哺乳动物已证明能够影响性别决定的转录因子WT1-KTS和SRY结合位点只存在于CYP19a基因中。在斜带石斑鱼CYP19b基因5旁侧上游-33nt存在一个TATA框,在-333nt处存在的脑芳香化酶特有的雌激素反应元件(ERE),以及更远端存在的神经生长因子诱导B蛋白(NGFI-B/Nurr77)识别位点NBRE,它们可能调节芳香化酶在中枢神经系统中的作用。另外,我们对斜带石斑鱼CYP19b基因第一个内含子序列也作了启动子元件分析,发现可能存在另两个转录起始。它们的5旁侧区序列也具有真核生物启动子序列特征,如都有TATA框等,但是否存在这样的转录产物需要进一步的实验证据。 为了进一步确定斜带石斑鱼CYP19a基因的转录起始位点,我们做了PrimerExtension实验,但是这个实验处于摸索阶段,还需继续完善。
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