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研究背景与目的:结肠癌是世界范围内第三常见的恶性肿瘤,死亡率较高。由于结肠癌早期诊断率较低,中晚期结肠癌细胞向周围组织浸润、侵袭或远端转移,而现有的治疗方法(手术切除、化疗等)也不能完全遏制结肠癌的复发和转移,这些造成了结肠癌在世界范围内的诊疗一直都是巨大的难题。肿瘤干细胞理论给结肠癌的诊治带来了曙光。该理论认为肿瘤干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的“种子细胞”,在某些干性基因的协作网络调控下,可维持肿瘤干细胞的“干性”或决定向肿瘤细胞分化,使肿瘤得以生长、发展、转移和复发,在整个肿瘤发生发展过程中起到关键作用。干性基因Nanog作为维持未分化胚胎细胞的多能性和自我更新的关键转录因子之一,在多种恶性肿瘤中异常高表达并可促进其侵袭转移。我们前期研究已发现结肠癌临床样本及结肠癌类干细胞中mi R-200s表达下调,Nanog在核酸水平表达异常升高,并伴随细胞发生上皮间质化转变(EMT)。已有大量文献表明,mi R-200家族可协同ZEB家族参与控制肿瘤干细胞的功能并通过控制肿瘤细胞EMT进程而发挥调控多种肿瘤转移发展的作用。已在结肠癌、乳腺癌、肺癌等上皮样肿瘤中被发现有肿瘤细胞EMT发生,在多种肿瘤转移模型中也证实了EMT可促进肿瘤细胞浸润、转移。而上皮间充质转变与其逆转过程间充质上皮转变(MET)的平衡是肿瘤细胞命运的精准调整,对肿瘤细胞的发展起到重要的调控作用。已有文献报道干性基因Nanog可促进结肠癌细胞增殖、侵袭和转移,但干性转录因子Nanog是如何调控结肠癌细胞EMT-MET的转录调控机制不清,且Nanog调控mi R-200s的机制尚未见任何文献报道。因此,我们探索干性转录因子Nanog通过mi R-200s调控结肠癌细胞EMT-MET的转录调控机制,为结肠癌的诊治开拓不同的新思路和潜在新靶点。研究方法:1.收集62例人结肠癌组织和癌旁组织,冻存于液氮罐保存,用于提取总RNA、总蛋白、核蛋白等;培养七支结肠癌细胞株(Caco2,LS174T,Lo Vo,HT-29,HCT116,SW480,SW620),提取总RNA、总蛋白。2.分别对62例人结肠癌组织、癌旁组织及7支结肠癌细胞株的总RNA进行m RNA、micro RNA逆转录,Real time q PCR(SYBR)检测Nanog、mi R-200c、mi R-200b的表达情况,并进行相关性分析;Western-blot检测7支结肠癌细胞株Nanog表达情况。3.构建Nanog过表达的慢病毒质粒及Nanog干扰的si RNA片段,选取表达Nanog较低的LS174T、SW480构建过表达Nanog稳定株,选取表达Nanog较高的HT-29、HCT116进行Nanog干扰,并在核酸和蛋白水平验证过表达或干扰Nanog效果。4.应用Real time qPCR(SYBR)分别检测Nanog过表达细胞株、Nanog干扰细胞中mi R-200c、mi R-200b的表达变化情况。5.在Nanog过表达细胞、Nanog干扰细胞及相对应的对照组中,应用MTT实验分析Nanog对细胞增殖能力、Transwell小室实验分析Nanog对细胞迁移及侵袭能力的影响。6.应用裸鼠皮下移植瘤实验分析Naong对裸鼠成瘤能力的影响。7.应用Real time q PCR、Western-blot实验分别检测Nanog过表达结肠癌细胞和Nanog干扰细胞及对应的对照组中细胞EMT指标(E-cadherin、Zeb1、Zeb2、Ncadherin)的变化。8.应用生物信息学及转录因子结合位点预测mi R-200c、mi R-200b启动子区域中可能的Nanog转录结合位点,构建8条双荧光素酶报告基因的缺失突变片段质粒。9.应用双荧光素酶报告基因检测系统分析Nanog对mi R-200c、mi R-200b启动子转录活性的影响。10.通过染色质免疫共沉淀技术,探索转录因子Nanog结合到mi R-200c、mi R-200b启动子的关键顺式作用元件。11.利用定点突变技术对mi R-200c、mi R-200b启动子的Nanog关键顺式作用元件进行点突变,通过双荧光素酶报告基因检测系统分析Nanog对野生型、突变型mi R-200c、mi R-200b启动子转录活性的影响。12.分别在过表达Nanog的结肠癌细胞株中转染mi R-200s mimics,应用MTT实验、Transwell小室实验分析mi R-200s mimics对过表达Nanog的结肠癌细胞株增殖能力、迁移及侵袭能力的影响。13.应用Real time q PCR、Western-blot实验分别检测mi R-200s mimics对Nanog过表达的结肠癌细胞EMT-MET的影响。结果:1.在7支结肠癌细胞株及62例结肠癌患者组织中,Nanog在核酸水平分别与mi R-200b、mi R-200c表达呈显著负相关。2.Nanog表达量从高到低的细胞株为:SW620,HCT116,HT-29,Caco2,LS174T,SW480,Lo Vo。成功构建过表达Nanog的LS174T、SW480稳定表达株,干扰Nanog的HT-29、HCT116细胞。3.过表达Nanog的结肠癌细胞mi R-200b、mi R-200c分别表达下调,干扰Nanog的结肠癌细胞mi R-200b、mi R-200c分别表达上调。4.过表达Nanog可致结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、致瘤能力显著增强。5.过表达Nanog的结肠癌细胞上皮向间质化转变(EMT)能力增强,干扰Nanog的结肠癌细胞上皮向间质化转变能力降低并呈间质向上皮转化(MET)。6.成功构建8条含Nanog顺式作用元件的mi R-200c、mi R-200b启动子的双荧光素酶报告基因质粒;Nanog可靶向抑制mi R-200c、mi R-200b启动子转录活性。7.Nanog可分别直接靶向结合到mi R-200c启动子区-761处、mi R-200b启动子区-630处关键顺式作用元件。8.突变Nanog关键顺式作用元件可恢复mi R-200c、mi R-200b启动子转录活性。9.mi R-200s mimics可部分逆转过表达Nanog的结肠癌细胞增殖、侵袭、转移能力及EMT进程。结论:干性转录因子Nanog通过直接转录抑制mi R-200c、mi R-200b启动子活性而调控结肠癌细胞EMT-MET可塑性,Nanog/mi R-200s/EMT轴将可能做为防治结肠癌的潜在基因新靶点,为结肠癌的早期诊断及治疗控制拓展一种新思路。