论文部分内容阅读
转基因技术是一种快速获得优良性状的现代育种新方法。建立稳定遗传的快速生长转基因鱼家系对水产养殖具有重要意义。本论文利用定量PCR方法，通过分析外源转植基因的基因型，在转“全鱼”生长激素(GH)基因鱼F3代自交子代群体中成功筛选到纯合子雄鱼和雌鱼，并结合测交试验进一步确证，从而建立了转GH基因鲤纯合子家系。转基因鱼纯合子与野生型黄河鲤杂交可以产生100％的转基因鱼，为转基因鱼的市场化奠定了基础，也为后期的研究提供了实验材料。
本论文比较分析了转基因纯合子雄鱼和对照雄鱼与同一尾对照雌鱼杂交时的受精率，子代孵化率，出膜时间及出膜体长，结果表明，转基因鱼纯合子的受精率和子代孵化率与对照鱼没有显著差异，子代的平均出膜时间显著小于对照鱼，出膜标准长则显著大于对照鱼。在早期生长实验中，两个转基因鱼家系（#TG3和#TG2）的特定生长率、饵料转化效率、蛋白沉积率均显著高于对照鱼，摄食率、脂肪含量则显著低于对照鱼，纯合子#TG3家系能量沉积率显著低于对照鱼，#TG2家系与对照无显著性差异。实验结果提示我们，转植的GH基因在早期发育阶段已有促生长效应，并且GH促进蛋白的合成和脂肪的分解。相反的，另一个快速生长的转基因纯合子雄鱼(14960)的子代家系(#TG1)的养殖参数均不及对照鱼，如特定生长率、饵料转化效率、蛋白沉积率，能量沉积率均低于对照鱼，摄食率、脂肪含量则显著高于对照鱼。因此，即使获得了具有快速生长特性的转GH基因鱼纯合子亲本，还需要结合经典选育种手段，才能培育出适合养殖要求的优良转基因鱼新品种。
本论文比较分析了转“全鱼”GH基因黄河鲤和对照鲤的摄食行为特征，食欲相关基因NPY,AgRP,orexin,POMC,CCK,CART,MC4R,CRH和CRH-R1的mRNA表达水平，并通过GH孵育培养的丘脑组织碎片进一步确证GH能够提高AgRPI的表达水平。结果表明，转GH基因鱼具有较大的摄食量和较快的摄食速度，GH显著提高了鲤端脑和下丘脑的AgRPImRNA的表达水平。我们推测过表达的GH可能通过作用于下丘脑，调节了食欲基因AgRPI的表达，从而影响了转GH基因鲤的摄食量和摄食行为。
食欲调节基因参与能量平衡和物质代谢的调节，特别是对能量分配，体重，摄食，脂肪代谢等有重要作用。从而进一步影响个体的生长，发育和繁殖等。为进一步研究能量调节和物质代谢对鱼类生长，发育，生殖等方面的影响，我们以斑马鱼为模型，利用基于“Goldengate”克隆的TALENs基因敲除技术，获得了食欲调节基因FTO的基因敲除斑马鱼。同时，由于FTO作为m6A(N6位甲基化的腺嘌呤)去甲基化酶发挥功能，我们也获得了参与m6A水平调节的另外两个基因METTL3（m6A甲基转移酶亚基）和ALKBH5（m6A去甲基化酶）的基因敲除斑马鱼。本论文中，我们共构建了14个TALENs表达质粒，识别METTL3，FTO和ALKBH5三个基因共7个敲除位点，获得了6种类型的基因敲除斑马鱼，包括小片段的突变和长片段的缺失。与果蝇和拟南芥中的研究结果不同，我们获得了METTL3基因纯合敲除的斑马鱼成鱼，并发现METTL3基因纯合敲除的斑马鱼生长缓慢，性腺发育异常，卵细胞功能缺陷，不能自然受精，人工授精后胚胎畸形，死亡率高。这为进一步研究脊椎动物中METTL3基因的功能，m6A的甲基化修饰以及能量调节和物质代谢对鱼类生长，发育，生殖等方面的影响奠定了基础。