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目的:肝细胞癌简称肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是当今最常见的恶性肿瘤之一,而阿霉素(Doxorubicin,Dox)是HCC常用的化疗药物之一,但存在诸如靶向性差、药物清除率过快以及毒副作用强等缺陷。研究发现,细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)可作为一种新型纳米级载体被广泛应用于药物递送系统的开发。中医“相须”配伍理论,它指的是通过将药性、功能相同或相似的药物联合应用来明显增强本身的药效学。基于中药“相须”配伍理论,将来源于中药蟹壳中的壳聚糖应用于现代药学的肿瘤靶向性给药系统,并且结合在负载化疗药物的载药囊泡表面,可以发挥更明显的药效学作用。本研究鉴于肿瘤组织内部pH值较正常组织低,利用羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMC)具有pH响应性和EVs的潜在优势,将其联合后可作为输送抗肿瘤药物的理想载体。我们研究该载药系统的药剂学特征并进一步研究体内体外对HCC的杀伤作用。1.设计并制备了羧甲基壳聚糖修饰的负载阿霉素细胞外囊泡(Doxorubicin-loaded Extracellular vesicles functionalized with Carboxymethyl chitosan,Dox@EVs-CMC)。2.探索Dox@EVs-CMC在体外杀伤肿瘤效果。3.探索Dox@EVs-CMC在体内抑瘤效果。方法:以CMC作为EVs的表面修饰剂,通过直接共同孵育法制备Dox@EVs-CMC,运用透射电子显微镜观察形态,动态散射光仪测定粒径,蛋白免疫印迹技术鉴定标志蛋白CD 63、HSP 70及TSG 101的表达,高效液相-质谱联用仪计算药物含量及载药率,药物释放实验模拟在不同pH值(pH7.0,6.0,5.0)下Dox@EVs-CMC的体内药物缓释情况。采用PKH67荧光染色观察人肝癌细胞PLC/PRF/5对EVs-CMC的摄取,采用MTS法检测Dox@EVs-CMC对人肝癌细胞PLC/PRF/5细胞毒性,采用流式细胞术检测Dox@EVs-CMC对人肝癌细胞PLC/PRF/5凋亡影响。通过尾静脉给药的方式,采用DIR染色观察在小鼠体内靶向肿瘤分布情况。同时,考察了Dox@EVs-CMC对于Hepa1-6荷瘤小鼠体内的实体瘤抑制作用,HE组织切片实验对Dox@EVs-CMC体内安全性进行初步评价。结果:1.Dox@EVs-CMC在透射电子显微镜下呈大小不一的椭圆样双层膜结构并且表面有一层黑色边缘;动态光散射仪观察平均粒径为(126.63±3.53)nm;蛋白免疫印迹检测表达CD 63、HSP 70及TSG 101;Dox@EVs-CMC的包封率为(1.103±0.019)%;pH为5.0时,体外释放实验显示Dox@EVs-CMC中Dox释放在具有pH响应性缓释效果,48h药物累积释放率可达(62.52±3.03)%。2.PKH67示踪实验显示相对于EVs组6h内肝癌细胞PLC/PRF/5能够更多摄取EVs-CMC,并且随着时间延长12h内呈团块样绿色荧光聚集在细胞质;与游离Dox组相比,Dox@EVs-CMC处理48h后肝癌细胞PLC/PRF/5的活性(77.04±3.15)%显著低于Dox组(90.00±5.10)%,而细胞凋亡率为(51.50±2.34)%显著高于Dox组(32.68±2.69)%,抑制率和凋亡率的差异均有统计学意义(P<0.05),而其随着时间的延长而细胞活性继续降低,72h肝癌细胞PLC/PRF/5的活性(52.85±10.73)%。3.在Hepa1-6荷瘤小鼠的体内实验中,Dox@EVs-CMC的抑瘤率达90%以上以及明显的肿瘤靶向能力,同时用药后小鼠主要器官组织无明显损伤迹象。结论:综上所述,通过对EVs的膜表面修饰,本研究已成功构建具有pH响应性羧甲基壳聚糖修饰的负载阿霉素细胞外囊泡纳米载药系统,并且证明构建的药物递送系统不仅对肝细胞癌细胞PLC/PRF/5具有明显的杀伤效果,还对体内肿瘤Hepa1-6展现出较强的肿瘤靶向作用且具有良好的生物安全性。