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溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,MH)是一种有荚膜的革兰氏阴性兼性厌氧菌,它是引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的主要病原性细菌。同样,该病原可感染绵羊及山羊,引起羊的呼吸道疾病,还可导致母羊乳腺炎和新生羔羊的急性败血症等。近年来,我国绵羊及山羊感染溶血性曼氏杆菌报道日益增多,该细菌成为一种常见的羊呼吸道病原,给养羊业带来一定的威胁。相关报道认为不同动物源和不同血清型的菌株在其生物学特征上存在一定差异,并在一定程度上具有宿主特异性。而目前对于羊源溶血性曼氏杆菌的病原分子特征研究甚少,这不利于对该病原引起的疾病的诊断和防控。此外,对于溶血性曼氏杆菌病的防控有赖于准确、快速的诊断以及安全有效的疫苗免疫。然而,我国目前尚无特异、敏感的血清学诊断试剂和广泛应用的商品化疫苗,国外应用的疫苗仅能提供部分免疫保护作用。因此,有必要对溶血性曼氏杆菌重要的免疫原蛋白及其诱导产生的免疫应答进行深入研究。但目前国内外对于溶血性曼氏杆菌重要免疫原的研究多以牛作为研究对象,少见针对羊的相关报道。本研究从四川西昌某发生呼吸道疾病的绵羊场分离获得5株绵羊源溶血性曼氏杆菌,并以此作为研究对象,对其LktA、OmpA等重要免疫原的分子特征进行了分析,并比较了溶血性曼氏杆菌感染后上述免疫原在羊体内诱导产生的抗体水平,以及这些免疫原的重组蛋白在小鼠体内所产生的免疫应答水平,从而为丰富绵羊源溶血性曼氏杆菌的分子生物学特征,以及血清学诊断试剂的开发和新型疫苗的研制提供有用的实验数据。主要的研究方法和结果如下:1.绵羊源血清1型及2型溶血性曼氏杆菌重要功能蛋白的分子特性分析从四川西昌某绵羊养殖场采集样本进行溶血性曼氏杆菌的分离鉴定,对分离株的lktA、ompA、plpE、plpF、ompP2、gs60基因进行PCR扩增并分析各基因的分子特征。结果共分离获得5株绵羊源溶血性曼氏杆菌(命名为S1-S5),其中2株为血清1型(S2、S4),3株为血清2型(S1、S3、S5)。通过其分子特征分析发现:(1)5株分离株lktA基因之间及与其他菌株之间均表现较大的序列差异。等位基因分型表明,S3、S4属于lktA1型,S1、S2属于lkt A8型。S5为lktA4型,这是首次在溶血性曼氏杆菌中发现等位基因型lkt A4;(2)5株分离株ompA基因之间及与其他菌株之间同样表现出丰富的多样性。等位基因分型表明,S2、S4、S5属于ompA2型,S3属于ompA4型,同时发表S1株属于一新的基因型,即ompA8型,这是首次发现ompA基因新的等位基因型;(3)2株分离株plpE基因之间存在差异,氨基酸序列分析发现血清型1型分离株S4株中,R2重复序列区中6肽重复序列的重复次数为5次,该重复模式首次在血清型1型菌株中出现;(4)3株分离株plpF基因之间存在差异,氨基酸序列分析发现血清型2型分离株S5在序列重复区域内的6肽重复序列重复次数为6次,该重复模式也是首次在血清2型菌株中出现;(5)ompP2和gs60基因在5株分离株之间及与其他不同血清、不同宿主的菌株间相对较为保守,其序列与菌株的动物来源和血清型的没有相关性。2.绵羊源溶血性曼氏杆菌重要免疫原的原核表达以及免疫原特性分析为了筛选羊源溶血性曼氏杆菌重要免疫原中的优势免疫原,评价其是否具有作为血清学诊断抗原的潜在价值,本研究分别对lktA、ompA、plpE、plpF、ompP2和gs60基因进行了PCR扩增,构建原核表达载体,经诱导表达后纯化重组蛋白。随后,以纯化重组蛋白作为包被抗原,通过ELISA的方法检测临床感染绵羊血清,筛选优势免疫原蛋白。结果成功构建了LktA、OmpA、PlpE、PlpF、OmpP2、Gs60原核表达载体,并获得纯化的重组蛋白。间接ELISA表明,Lkt A、OmpA以及Gs60与感染的绵羊血清结合能力最强,是优势免疫原,是建立绵羊溶血性曼氏杆菌感染的血清型诊断方法在潜在优势抗原。为了能够评价本研究制备的各重组蛋白是否具有作为亚单位疫苗候选蛋白的潜力。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠,收集免疫后不同时间点的小鼠血清,并以此血清作为一抗、以重组蛋白作为包被抗原,采用ELISA方法评价免疫后不同时间血清特异性抗体的变化情况。结果发现,rlktA、rompA、rplpE、rplpF、rGS60产生的抗体水平高,持续时间长,是亚单位疫苗潜在的候选抗原。最后,为评价各重组蛋白诱导产生的抗体是否具有潜在的免疫保护性,以溶血性曼氏杆菌全菌蛋白作为包被抗原,通过ELISA的方法检测各重组蛋白免疫后血清特异性抗体与全菌蛋白的结合能力。结果表明,由rompA、rplpE和rplp F诱导产生的抗体与菌体蛋白的结合能力最强,说明rompA、rplpE和rplpF最具诱导产生保护性免疫的潜力。总之,本研究分离获得的5株分属于血清1型及血清型2型的绵羊源溶血性曼氏杆菌,对其LKT、OmpA、PlpE、PlpF、OmpP2、Gs60等重要免疫原的基因分子特征进行了分析,进一步丰富了羊源溶血性曼氏杆菌的分子生物学特征,并同时筛选获得具有开发血清学诊断技术的优势免疫原和作为亚单位疫苗的潜在抗原,从而为开发羊源溶血性曼氏杆菌血清学诊断技术和新型疫苗的研制提供试验数据。