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目的:翼状胬肉是眼科较为常见的眼表疾病之一,现研究表明,翼状胬肉是一种组织增生性结膜疾病,其发病机理仍不十分清楚,可能与细胞异常增殖和凋亡异常有关。由于翼状胬肉术后的高复发,有资料表明其与肿瘤有相关性,端粒酶在翼状胬肉的高表达可能是一个重要原因,所以有必要将端粒酶进行深入的研究。本实验研究进展期翼状胬肉组织端粒酶的活性和端粒酶逆转录酶(human telemerase reverse transcriptase, hTERT)mRNA的表达。增殖细胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen, PCNA)作为DNA聚合酶的辅助蛋白直接参与了细胞的增殖活性,在静止期的细胞内含量很少,从G1晚期开始增加,S期达高峰,G2期、M期明显下降,故被认为是一种准确简便且可了解细胞增殖状况的重要研究指标。翼状胬肉为增生性病变,本研究拟对病例组与正常组PCNA的免疫组化比较。VEGF是一种功能强大且能产生多种生物学效应的细胞因子,它是1989年Ferrarra在牛垂体滤泡星状细胞培养液中分离纯化出来的一类糖蛋白,是血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)家族的一个成员,分子量为34 - 45 KD,序列高度保守,广泛分布于人和动物体内的大脑、肾脏、肝脏、脾脏、胰腺和骨骼等组织中,它是最直接的血管内皮细胞促分裂素,并且作为血管生成旁分泌刺激因子而被分泌。VEGF是目前研究发现的功能最强的血管形成促进因子,它可以增强微血管的通透性,刺激内皮细胞分裂,增加组织因子和某些蛋白酶的产生。VEGF主要与VEGF受体相互作用,通过内皮细胞的细胞内信号转导途径引起血管通透性增加,促进血管内皮细胞增殖、迁移,从而诱导血管新生。有研究表明血管的生长和成熟是高度复杂和协调的过程,需要用多种配体序贯活化一系列受体而完成。在正常生理性血管生长过程中,如胚胎形成、骨骼生长等,VEGF信号代表重要的限制酶,在病理情况下,可出现VEGF的异常表达,在缺血性疾病中,缺氧可刺激VEGF表达上调,通过对内皮细胞强烈的促有丝分裂作用,促进新生血管形成;VEGF可以增加血管的通透性,尤其是微小血管的通透性,引起血浆蛋白渗漏到细胞外基质,在细胞外基质中沉着,为成纤维细胞和血管内皮细胞的迁入提供条件基质,为肿瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供营养。以往翼状胬肉被认为是一种结膜组织的变性,近期的研究结果认为,翼状胬肉可能是一种生长过程的紊乱。亦有研究表明,转基因鼠在皮肤上过度表达VEGF,明显影响皮肤的血管新生,使皮肤出现类似牛皮癣样的炎性反应。所以更有必要从以上的不同角度综合进行研究。本文从以下几个方面进行探讨:1.通过对端粒酶的研究,深入了解翼状胬肉的发病机制,为预防治疗翼状胬肉提供新思路。2.通过对VEGF表达的研究,了解翼状胬肉的发生机制,提供降低其复发率的治疗理论依据。3.探讨端粒酶表达与VEGF表达的关系。方法:从本院2009.1—2009.9门诊初发的进行期翼状胬肉手术患中选择标本二十二例,入选标准:男性11例,女性11例,年龄35-75岁,病程8月至20年,所有病例均无其他结膜、角膜疾病,排除巩膜炎,色素膜炎等有关的疾病,排除肿瘤及免疫系统等引起眼部增生的全身疾病,术后经病理检查确诊是翼状胬肉的。另取年龄和条件相匹配的正常球结膜(2mm×2mm)8例作为对照,其中男性5例,女性3例,年龄32-65岁。标本经10%甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋,作3μm连续切片,分别进行VEGF、PCNA、TERT免疫组织化学染色,并且对hTERT进行原位杂交染色。结果判断:胞浆内有呈棕黄色颗粒反应产物的为阳性细胞。光镜下每例标本切片任取5个视野进行细胞计数,至少计数500个细胞,以阳性细胞占细胞总数的百分比表示阳性表达率。A为阳性细胞数分级:0～<1%=0,1～<10%=1,10～<50%=2,50～<80%=3,80～100%=4。B为阳性细胞显色强度分级:0(阴性),1(弱阳性),2(阳性),3(强阳性)。IHS=A×B统计方法:研究病例组与正常组间均采用染色强度及染色阳性率乘积的IHS评分,成组设计两样本比较的秩和检验,病例组hTERT和VEGF两样本比较的秩和检验。所有分析采用spss16.0统计软件包,取a=0.05做为检验标准。结果:1病例组与正常组的VEGF:VEGF蛋白主要定位在血管内皮和细胞浆表达细胞浆,胞核无着色,阳性部位主要在上皮中的杯状细胞(Fig.1)。两组IHS数值比较Z值为-3.324,p值为0.001(<0.05)差异有统计学意义(Table1)。2病例组与正常组的PCNA:PCNA抗体主要在细胞核表达(Fig.2)。两组IHS数值比较Z值为-3.371,p值为0.001(<0.05)差异有统计学意义(Table2)。3病例组与正常组的hTERT:hTERT抗体主要在细胞浆表达(Fig.3)。两组IHS数值比较Z值为-4.256,p值为0.000(<0.05)与对照组的差异有统计学意义(Table3)。4病例组与正常组的hTERT mRNA:hTERT mRNA主要定位细胞浆,胞核无着色(Fig.4)。两组IHS表比较Z值为-3.415,p值为0.001(<0.05)差异有统计学意义(Table4)。5病例组hTERT与VEGF的比较:两组IHS数值比较Z值为-2.072,p值为0.038(<0.05)两组的差异有统计学意义(Table5)。结论:病例组VEGF,PCNA,hTERT,hTERT mRNA染色级别均明显高于正常组,可以认为进展期翼状胬肉中以上指标与正常组比较有明显表达。进一步证实了其与细胞异常增殖和凋亡异常有关。进展期翼状胬肉中端粒酶与VEGF有一致性表达,端粒酶表达强度高于VEGF的表达。