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在细菌中发现了以磷硫酰化替代磷酸骨架的DNA。五个基因决定了这种形式的DNA修饰,命名为dnd基因。含有这种修饰的DNA(Streptomyces lividans 66)在Tris凝胶电泳过程中具有降解的特征。这种降解现象称为Dnd表型(DNA degradation phenotype)。
DNA磷硫酰化修饰的表型可用电泳过程中的TAE Buffer(Tris、乙酸、EDTA)鉴定,但可重现性差,结果不稳定。本研究建立了一种简单、稳定和快速的DNA磷硫酰化修饰表型的鉴定方法。通过用乙酸和H2O2反应生成的PAA(peracetic acid),复配TAE(pH7.5,0.8mMEDTA)作为磷硫酰化修饰DNA切割试剂,可非常有效地切割质粒DNA和基因组DNA,进行Dnd表型鉴定。
生物信息学比对表明,dnd基因簇广泛存在于细菌中。对相应菌株进行了Dnd表型鉴定,证明DNA的磷硫酰化修饰广泛存在于微生物中。
DNA磷硫酰化的骨架修饰具有位点选择性。质粒pHZ209在菌株S.lividans 66中倾向于在一个特定的DNA位点进行优先修饰,而质粒其它潜在的修饰位点则呈现频率较低的修饰;当dndB基因染色体同框缺失后,发生在pHZ209中的优先修饰位点的修饰丰度减弱,同时其它潜在的修饰位点的修饰丰度增强。研究还发现,质粒尽管潜在的修饰位点有多处,但是凝胶和测序结果说明造成双链断裂的修饰每次只在质粒的一个位点上发生。推测在质粒潜在位点上的对链修饰最多仅发生一次。
本研究通过对质粒pHZ209修饰断裂位点的克隆和测序,获得了14个修饰位点。通过比对分析,质粒修饰位点附近存在共有保守序列:5-c-cGGCCgccg-3。系统突变证实,序列(5-c-cGGCCgccg-3)中的4个核心碱基(5-GGCC-3’)高度保守,是修饰发生所必需的,而两翼序列和“gccg”只在dndB突变株中对修饰有影响。推测dndB基因直接或间接参与了修饰复合物对优先修饰位点的修饰,帮助稳定并加强了此位点的修饰。
当带有天然启动子的dndB基因遗传回补dndB缺失的HXY2菌株后,质粒pHZ209的优先修饰位点的修饰丰度部分恢复;而回补带有完整基因簇以及dndA,dndC,dndD和dndE各基因分别同框缺失的基因簇后,都能在dndB缺失的HXY2菌株中完全回补优先修饰位点的修饰丰度,即与野生型菌株的优先位点的修饰丰度相似。优先修饰位点两翼序列突变后,结果来自不同宿主的优先修饰位点的修饰丰度均被改变:来自野生型菌株的这个位点的优先修饰丰度被减弱,而HXY2的优先修饰彻底消失。这些结果暗示菌株中的修饰系统在选择这个优先位点作为底物时,是由多处顺式作用元件和多个反式作用因子相互交叠,共同作用的结果。
本研究对dnd磷硫酰化修饰基因簇的五个基因进行了转录水平的分析。通过RT-PCR的方法确定了dnd磷硫酰化修饰基因簇含有双向转录的转录单元:dndA方向和dndBCDE方向。dnd基因簇在菌体的不同生长时期的mRNA转录情况:以S.lividans的16S rRNA的rrnA基因为内标,半定量检测到磷硫酰化修饰基因簇在菌体生长早期和对数生长早中期期间,其表达量均较丰富;而对数生长后期至衰亡期各基因mRNA转录水平急剧下降。转录分析还发现dndB对dndA有一定程度的阻遏调控作用。
改造了pET-15b蛋白表达载体,构建了在其N端带有StrepTagⅡ小标签的衍生表达载体pJTU2036。在此载体上构建了Dnd系列蛋白表达载体。在E.coli中得到dndA,dndB和dndC的可溶性蛋白超量表达。将整合型载体pIB139改造成带有Strep-tagⅡ标签的表达载体pJTU2032,适合在链霉菌中对链霉菌的靶蛋白进行研究。进一步以pJTU2032为载体成功构建了带有ErmE启动子的dndABCDEF各目标蛋白。通过结合转移将它们分别整合到了S.lividans中,为实现链霉菌目标蛋白在链霉菌自身中进行组成型表达,研究各靶蛋白与宿主中的蛋白、蛋白和DNA间的相互作用奠定基础。
以pET-44b为载体,成功获得了带有NusA标签的dndB蛋白和分截成两两不同的六个dndB结构域的可溶性表达,以及dndD和dndE的可溶性蛋白超量表达。
开展了DNA磷硫酰化修饰的生物学意义的初步研究。对S.lividans的DNA磷硫酰化修饰菌株和相应的突变菌株进行了生长曲线测定和一些氨基酸和化合物对它们的生理影响。与野生型菌株相比,HXY1和HXY6的代时延滞,HXY2、HXY1和HXY6的稳定期长。L-Ala对HXY1和HXY6的菌体生长严重抑制。硫链丝菌素、分枝氨基酸L-Valine、L-Isoleucine和L-Thrine对HXY1和HXY6有一定程度的生长抑制作用。整合有dndA基因的天蓝链霉菌M14能使其提前进入次级代谢产物的产生阶段(平板蓝紫色色素快速产生),在氧化压力刺激下,也呈现类似的表型-先红后转成蓝紫色色素。结果暗示dndA具有多效性,在菌体生理条件下具有多重功能。以上结果为进一步发现DNA磷硫酰化修饰的生物学意义提供线索。