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目的骨髓中存在一定数量的骨髓基质干细胞(BMSCs, bone marrow stromal stem cells),这些细胞具有自我复制能力和巨大的分化潜能,在不同的条件下,可分化为骨、软骨、神经、心肌和脂肪等中胚层来源的组织。有研究结果表明,胞嘧啶类化学物质5-氮胞苷可诱导骨髓基质干细胞向心肌细胞分化,这使BMSCs成为细胞移植治疗缺血性心肌病最有前途的细胞之一。本实验旨在通过对大鼠骨髓基质干细胞进行体外分离、培养、动态观察BMSCs的生长特点;观察在不经过任何诱导,将扩增的BMSCs与心肌细胞共同培养,观察BMSCs分化为心肌细胞的能力。并且通过GFP质粒转染骨髓基质干细胞,观察GFP在标记BMSCs中的表达能力,以期进一步了解骨髓基质干细胞的生物学特性,为其应用于临床提供更可靠的理论依据。实验方法1.全骨髓贴壁培养法体外分离,培养大鼠骨髓基质干细胞,倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态及生长状。2.差速贴壁法体外分离,培养心肌细胞,倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态及生长状况。3.将提取的GFP质粒转染培养好的第3代骨髓基质干细胞,Olympus荧光显微镜下观察细胞的转染效率。4.将转染后的骨髓基质干细胞离心收集后按1∶3的比例加入到培养好的心肌细胞中共培养,Olympus荧光显微镜逐日观察细胞变化。实验结果1.大鼠骨髓基质干细胞的形态学观察:骨髓基质干细胞接种于培养瓶中后24h用倒置显微镜观察大部分细胞已贴壁,贴壁生长的细胞以分散、克隆集落的方式增殖,细胞大多呈梭形,类似成纤维细胞,偶有宽大平坦的多角形细胞。7-10d后克隆集落逐渐增多,随着集落生长的不断扩大,细胞融合。传代培养后细胞不再以集落方式生长,而呈分布均匀的纺锤形细胞生长。2、心肌细胞的形态学观察:心肌细胞一般在24 h后会自动从组织块周围迁出,刚开始从组织块中迁出时,心肌细胞呈现梭形,伴随着迁出细胞的增多,组织块周围的心肌细胞呈现出不规则的圆形、三角形。细胞间紧密连接,整体形如铺路石样,随着细胞生长密度的不断增加,细胞间伸出的伪足会交织成网状。有时一些细胞紧密结合形成细胞簇,呈现出放射状或同心圆状,经过2～3 d培养,这些细胞簇会自发地搏动。3、GFP转染骨髓基质干细胞的结果:转染GFP后,细胞仍贴壁生长,呈梭形或多角形,仍分裂增殖,但增殖速度有所降低。荧光显微镜下, 24 h可见有绿色荧光表达,但数量较少,强度较低,48 h可见细胞发出强烈的荧光。4、共培养后BMSCs形态学与生长行为变化:在共培养后,BMSCs增殖速度缓慢,并且容易变成多角形或扁平,随着共培养时间的延长,有相当数量的BMSCs发生细胞崩解等死亡现象。24h后发现有很多贴壁的未跳动的尖梭形细胞靠近搏动的心肌细胞;48h后,这些尖梭形细胞呈集落样生长,并且在荧光显微镜下观察到个别被标记的BMSCs呈肌管样结构,这些BMSCs通常靠近搏动的未标记的心肌细胞;在第4天,部分与心肌细胞接触的被标记的BMSCs开始呈微弱心肌样搏动。同时,也有些BMSCs开始死亡,至64h已有相当一部分BMSCs发生死亡。结论1.可以从大鼠骨髓中分离出骨髓基质干细胞,经体外培养可大量扩增。2.GFP转染BMSC后可以长期高效表达,而且对宿主细胞毒性很小,是一个非常理想的组织工程种子细胞的示踪工具。3.大鼠骨髓基质干细胞在不用诱导剂的情况下,与心肌细胞共培养后可以分化为心肌细胞。