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研究目的本研究拟通过制备人的洗涤血小板,并在TLR4/TLR2单克隆抗体阻断前后分别给予LPS/PGN刺激,初步探讨体外条件下LPS/PGN对血小板凋亡的诱导效应及LPS-TLR4、PGN-TLR2通路在其中发挥的作用,为脓毒症相关性血小板减少症的发病机制提供基础研究证据,为改善脓毒症相关性血小板减少症患者的预后提供可能的治疗靶点。内容第一部分:体外条件下,LPS诱导人血小板凋亡的研究及TLR4的介导作用制备人洗涤血小板,浓度梯度组用不同浓度的LPS分别与洗涤血小板进行体外孵育,观察LPS对血小板凋亡的诱导效应并筛选出诱导血小板凋亡的LPS最适浓度。TLR4单克隆抗体阻断组以凝血酶为阳性对照,观察TLR4单克隆抗体阻断前后,LPS对血小板凋亡诱导作用的变化。第二部分:体外条件下,PGN诱导人血小板凋亡的研究及TLR2的介导作用制备人洗涤血小板,浓度梯度组用不同浓度的PGN分别与洗涤血小板进行体外孵育,观察PGN对血小板凋亡的诱导效应并筛选出诱导血小板凋亡的PGN最适浓度。TLR2单克隆抗体阻断组以凝血酶为阳性对照,观察TLR2单克隆抗体阻断前后,PGN对血小板凋亡诱导作用的变化。方法制备洗涤血小板,建立体外反应体系,分别设置LPS/PGN浓度梯度实验组及TLR4/TLR2单克隆抗体阻断实验组,以凝血酶诱导的血小板凋亡作为阳性对照,应用流式细胞技术测定不同处理组血小板的PS外翻及ΔΨ去极化,应用凋亡蛋白抗体芯片法筛查血小板凋亡相关蛋白的表达水平,应用蛋白印记技术检测促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。结果LPS及PGN均以浓度依赖性为特点诱导血小板发生PS外翻及ΔΨ去极化。凋亡蛋白抗体芯片结果显示,在LPS及PGN刺激下,血小板多种凋亡相关蛋白的表达发生变化,主要以促凋亡蛋白的升高及抗凋亡蛋白的降低为主。WesternBlot结果提示LPS及PGN诱导下,血小板促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax及Bak的表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达也呈增高趋势。而TLR4/TLR2单克隆抗体阻断实验表明,LPS-TLR4/PGN-TLR2通路至少部分介导了LPS/PGN诱导的血小板凋亡的发生。结论1.LPS及PGN均可诱导血小板发生凋亡,表现为PS外翻、ΔΨm去极化、Caspase-3活性增高、Caspase-8、Bak、Bax及Bcl-2等凋亡相关蛋白表达增高;2.内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径均参与了LPS/PGN诱导的血小板凋亡;3.TLR4参与了LPS诱导的血小板凋亡的发生,TLR4单克隆抗体至少可以部分阻断LPS诱导的血小板凋亡;TLR2参与了PGN诱导的血小板凋亡的发生,TLR2单克隆抗体至少可以部分阻断PGN诱导的血小板凋亡。