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目的:黄连素最初是从中药黄连中分离出的一种药效单体成分,可用于治疗关节炎、结肠炎等炎症疾病。慢性结肠炎属于结肠炎发病的表现形式之一,病情长且常反复发作,严重影响病人的生活质量。REV-ERBα是生物钟的核心组成部分,又可作为人类炎症疾病的独特治疗靶标,与炎症的发生与发展有着密切的联系。黄连素治疗慢性结肠炎的药效是否具有时辰节律性,且REV-ERBα在此过程中的作用尚不清楚。因此,本论文将明确黄连素治疗慢性结肠炎药效的时辰节律性,并阐明生物钟蛋白REV-ERBα的靶点作用及黄连素时辰药效的机理。具体研究目标如下:(1)建立慢性结肠炎小鼠动物疾病模型,明确慢性结肠炎疾病发病程度的时辰相关性以及黄连素对慢性结肠炎治疗的时辰依赖性;(2)验证黄连素抗炎药效是否依赖REV-ERBα靶点;(3)解析黄连素通过激动REV-ERBα靶点产生时辰药效的分子机制。方法:1.以野生型小鼠为实验对象,通过口服葡聚糖硫酸钠构建慢性结肠炎疾病模型。通过对比正常组小鼠来分析慢性结肠炎小鼠的体重变化、疾病活动指数、结肠长度以及丙二醛含量和髓过氧化物酶含量;通过收集6个不同昼夜时间点(ZT2,ZT6,ZT10,ZT14,ZT18,ZT22)的结肠炎小鼠的结肠组织,并采用实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹分析炎症因子(Nlrp3,IL-1β,IL-6,IL-18和Ccl2)的表达,从而表征小鼠慢性结肠炎疾病模型在不同时间点的严重程度。2.采用REV-ERBα敲除小鼠,提取骨髓来源的原代细胞。通过对原代细胞加药黄连素检测炎症因子表达水平、丙二醛酶及髓过氧化物酶水平。分别采用qPCR、蛋白免疫印迹技术及ELISA探讨黄连素的抗炎药效,明确REV-ERBα在黄连素抗炎药效中的关键作用。3.在ZT2和ZT10分别对慢性结肠炎小鼠给予中药单体黄连素,通过qPCR及ELISA检测炎症因子表达、丙二醛含量和髓过氧化物酶含量,分析慢性结肠炎小鼠疾病模型中黄连素抗炎作用的时辰节律性;并通过药代动力学实验分析ZT2和ZT10的药代动力学行为。4.采用qPCR及蛋白免疫印迹技术,结合双荧光素报告基因,Gal4共转染等生物学手段检测黄连素对REV-ERBα的两个靶基因Bmal1和Nlrp3表达水平和转录活性的影响,同时还评估黄连素对生物钟蛋白REV-ERBα蛋白的配体结合区域(LBD)之间的相互作用。结果:1.慢性结肠炎具有时辰节律性。与正常小鼠比较,慢性结肠炎模型组小鼠体重显著下降,且疾病活动指数评分明显增高,结肠长度显著缩短,证明小鼠慢性结肠炎模型造模构建成功。于不同时间点(ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22)收集慢性结肠炎小鼠结肠组织,分析了5种炎症因子(Nlrp3,IL-1β,IL-6,IL-18和Ccl2)的m RNA、蛋白表达趋势及另外2个象征结肠炎症严重程度的指标丙二醛含量和髓过氧化物酶含量的趋势,发现表达曲线最高点与最低点的比值最小的有将近5倍,最大的有30多倍。可见小鼠体内慢性结肠炎疾病具有强烈的节律变化,得出小鼠慢性结肠炎具有时辰节律性的结论。2.黄连素抗炎药效依赖生物钟蛋白REV-ERBα。造模组小鼠口服黄连素,分析DAI、结肠长度、MDA、MPO、炎症因子的m RNA及蛋白表达,在动物水平上表明黄连素具有抗炎疗效,且100 mg/kg的剂量抗炎效果最为显著。与未给药组相比,黄连素的抗炎效果多达40%。此外在BMDM和THP-1的细胞水平上也表明黄连素具有抗炎药效,且浓度为5μM时抗炎效果最为显著,甚至优于阳性对照SR9009。提取REV-ERBα基因敲除小鼠骨髓来源的原代细胞进行黄连素加药处理,经qPCR及蛋白免疫印迹实验证实黄连素抗炎药效丧失。以上研究表明黄连素抗炎药效依赖生物钟蛋白REV-ERBα。3.黄连素抗炎药效具有时辰节律性。在ZT2与ZT10对慢性结肠炎小鼠进行口服黄连素处理,检测炎症因子表达水平及MPO含量。研究数据显示在相同剂量下ZT10的治疗效果远好于ZT2,且从指标IL-6的治疗效果来看多达2.5倍。此外研究发现,在ZT2与ZT10黄连素药物的暴露不具有显著差异,并不构成抗炎药效时辰差异的影响因素。4.黄连素激动生物钟蛋白REV-ERBα。Bmal1和Nlrp3启动子区段的双荧光素报告基因结果表明黄连素能显著抑制REV-ERBα的两个靶基因Bmal1和Nlrp3启动子区段的活性。Gal4-共转染实验结果表明黄连素能显著增强REV-ERBα的转录抑制活性。此外qPCR及蛋白质免疫印迹结果证实黄连素能降低Bmal1和Nlrp3的m RNA及蛋白表达水平,且呈浓度依赖性。以上数据均表明黄连素是生物钟蛋白REV-ERBα的激动小分子化合物。结论:1.明确了慢性结肠炎疾病严重程度具有时辰依赖性。2.发现了黄连素抗炎药效依赖生物钟蛋白REV-ERBα。3.明确了黄连素抗炎药效的时辰依赖性。4.阐明了黄连素可通过激动生物钟蛋白REV-ERBα产生时辰药效。