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干扰素γ（Interferon γ），作为干扰素系统中重要的Ⅱ型IFN，是由Th1细胞产生的细胞因子，是主要的巨噬细胞刺激因子，它对机体免疫反应有多方面的调节作用，能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞活性，促进Ig的转换，具有抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用。本研究利用黑青斑河鲀基因组数据库丰富的序列信息结合分子生物学的方法，克隆了黑青斑河鲀IFNγ1和IFNγ2基因的ORF序列，并对其分别进行了序列特征分析和同源性比对，了解黑青斑河鲀IFNγ1和IFNγ2与其他脊椎动物的IFNγ结构异同及进化关系；同时我们对IFNγ1和IFNγ2在各组织的分布情况进行了RT—PCR半定量分析，以了解其表达模式；然后，我们利用大肠杆菌原核表达系统对IFNγ1和IFNγ2分别进行了融合蛋白表达，并纯化出重组蛋白；通过头肾细胞增殖实验鉴定了所得到重组蛋白的活性，并利用得到的重组蛋白刺激头肾细胞，检测IFNγ下游信号通路中多个因子的表达水平的变化情况以对所得到的重组蛋白的功能进行初步的探讨。本研究主要内容及结果如下：
1.本研究克隆得到的黑青斑河鲀IFNγ1基因ORF长为540bp，编码一段179个氨基酸、分子量大小约为22.5kDa的前体蛋白。黑青斑河鲀IFNγ2基因ORF长为567bp，编码一段长188个氨基酸，分子量大小约为23.9kDa的前体蛋白。序列分析表明它们基因结构、序列特征及保守结构与已发现鉴定的其他物种IFNγ基因都较为相似。氨基酸序列比对分析发现IFNγ2与红鳍东方鲍IFNγ最为接近，而在鱼类中新发现的IFNγ1与斑马鱼、鲶鱼以及草鱼的IFNγ1一致性都比较低，且与其自身的IFNγ2的一致性也很低。采用半定量RT—PCR技术研究IFNγ1和IFNγ2基因的表达模式，结果表明，黑青斑河鲀IFNγ2基因在所检测的各组织中广泛表达，而IFNγ1基因仅在肠组织中检测到低水平的表达，这与IFNγ2基因的表达模式差异较大。
2.利用已经克隆得到的IFNγ1和IFNγ2ORF序列，设计酶切引物，将其扩增并连接到表达载体上，转入大肠杆菌，通过优化表达条件进行表达，得到了大量的以包涵体形式存在的IFNγ1重组蛋白和适量的IFNγ2重组蛋白。在优化表达条件未能促进可溶性的情况下，我们对包涵体IFNγ1进行了纯化、变性和复性，获得了重组蛋白IFNγ1。
3.利用得到的不同浓度的黑青斑河鲀IFNγ1重组蛋白刺激黑青斑河鲀的头肾细胞，以检测其对头肾细胞增殖的作用。结果显示，头肾细胞增殖程度随重组蛋白浓度的增加而增加。同时，我们对刺激后的头肾细胞中IFN信号通路中的IRF1，MHCⅡ，ICSBP和MX等下游因子的表达情况进行了检测。结果表明纯化所得到的IFNγ1重组蛋白具有其特定的生物学活性，既表现出与之前研究的IFNγ相同的特点，又显示出一定的功能差异。