论文部分内容阅读
布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病），是由布鲁氏菌（Brucella）侵入动物机体内，引起的一种人畜共患病。该病主要会引起慢性感染及波状热，甚至会引起流产和不孕不育，严重危害畜牧业的发展，威胁着人类生命健康。因此，控制该病的扩散已成为现在最需要解决的问题，而对容易感染的动物和人群，最有效的控制途径就是进行疫苗的接种。本研究利用DNASTAR软件对已知omp31基因序列做了系统分析，通过蛋白质的亲水性，最大亲水性，柔韧性，测潜在的蛋白质抗原决定簇，表面可能性进行预测，找到其抗原决定簇区域。该蛋白是一种跨膜脂蛋白质，形状为β折叠桶形；分子的N末端具有很强的信号肽序列。在该蛋白的48-74以及193-227氨基酸残基的序列，很可能就是该蛋白的抗原决定簇区域。此外，以猪型布鲁氏菌S2作为研究对象，利用实验室已构建的含有omp31片段的重组质粒及bls质粒为模板，进行PCR扩增得到omp31、omp31193-227基因片段，以及去掉N短9个氨基酸的bls基因片段；利用融合PCR方法进行omp31193-227抗原决定簇区域和N端缺失9个氨基酸的bls融合基因片段的扩增。将扩增好带有酶切位点的omp31193-227-bls、omp31、omp31193-227、bls基因片段，与pET-28a进行连接，经过菌落PCR、双酶切及测序鉴定，成功构建出了重组质粒pET-28a-omp31193-227-bls、pET-28a-omp31、pET-28a-omp31193-227、pET-28a-bls。将成功的质粒导入表达菌种TL129中，用诱导剂IPTG进行诱导表达。成功表达出Omp31193-227-BLS蛋白、Omp31蛋白及BLS蛋白。经超声波破碎，在SDS-PAGE蛋白电泳进行分析显示，三种重组蛋白都是以包涵体的形式存在的。经包涵体洗涤、His-tag亲和层析柱的纯化，SDS-PAGE检测Omp31没有纯化出理想的蛋白。利用实验室已构建好的pET-28a-omp3148-74、pET-28a-bls全长进行蛋白质纯化得到抗原，用注射家兔得到的血清抗体，通过ELISA实验、免疫双扩散实验及凝集实验进行抗原抗体体外免疫反应，结果显示：BLS所携带的Omp31的48-74个氨基酸多肽比BLS本身的免疫原性强，说明BLS十聚体的结构具有聚合放大的功能，这与BLS本身的结构有很大的关联。因此，Omp3148-74-BLS抗原将成为布鲁氏菌最为合适的基因缺失疫苗标志之一。