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骨髓间充质干细胞(MSC)是继造血干细胞之后发现的另一类骨髓成体干细胞,具有重要的造血调控和免疫调节作用。对正常的造血干细胞(HSC)和白血病细胞都产生影响。目的1.探讨非白血病MSC对人类急性髓性白血病(AML)细胞系HL-60细胞增殖分化的影响以及相关分子机制。2.比较急性髓性白血病MSC,急性髓性白血病完全缓解后MSC以及非白血病MSC的部分生物学特性。3.比较急性髓性白血病MSC,急性髓性白血病完全缓解后MSC以及非白血病MSC对HL-60细胞影响。方法第一部分1.应用密度梯度离心法从非白血病骨髓中分离单个核细胞,进一步贴壁培养分离MSC。建立MSC细胞层后,直接将HL-60细胞种植于MSC细胞层上,两者共培养。2.应用直接计数法,在不同时间计数单独培养的和与MSC共培养的HL-60细胞,描绘其时间-数量曲线。3.应用流式细胞仪检测与MSC共培养的HL-60细胞和单独培养的HL-60细胞的细胞周期以及凋亡的细胞比例。4.应用流式细胞仪检测与MSC共培养的HL-60细胞和单独培养的HL-60细胞的CD11b与CD14的表达。5.应用流式细胞仪检测与MSC共培养HL-60细胞和单独培养的HL-60细胞Survivin蛋白和Bcl-2蛋白的表达。6.瑞氏染色后光镜下观察与MSC共培养后的HL-60细胞,并计算分化率,以单独培养的HL-60为对照。7.吞墨实验检测与MSC共培养后的HL-60细胞的功能。第二部分1.原位瑞氏染色观察急性髓性白血病MSC,急性髓性白血病完全缓解MSC以及非白血病MSC的细胞形态。2.原位瑞氏染色后计数CFU-F的个数。3.计数从种植单个核细胞到MSC细胞融合的时间。4.采用直接计数法,在不同时间计数以上各组MSC的数量,并描绘其时间-数量曲线。5.流式细胞仪检测各组MSC的免疫表型和细胞周期并计算DI值。6.采用直接计数法,在不同时间计数与各组MSC共培养的HL-60细胞并比较。7.流式细胞仪检测与各组MSC共培养的HL-60细胞的CD11b和Survivin蛋白表达,以及细胞周期分布并比较。8.瑞氏染色后光镜下观察与各组MSC共培养后的HL-60细胞形态,计算分化率并比较。统计学处理应用STATA统计软件进行统计分析,各组变量记录为均数±标准差。非白血病MSC共培养的HL-60细胞与单独培养的HL-60细胞之间的数据比较采用t检验,与不同组MSC共培养后HL-60细胞之间的数据比较采用方差分析。各个指标之间的相关性评估采用简单线性回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果第一部分1.非白血病MSC与HL-60细胞共培养后,HL-60细胞的增殖明显受抑,这种作用在5-7天显著(第3天比较P=0.07,第5天比较P=0.01,第7天比较P<0.01)2.细胞周期检测发现与MSC共培养后HL-60细胞分布于G0/G1期比例明显增加(对照组为47.0±9.0%,实验组为70.0±16.0%,P=0.003)。并且在G0/G1期左侧出现凋亡峰。3.HL-60细胞的Survivin蛋白和Bcl-2蛋白表达,在与MSC共培养后同时下调(Bcl-2:对照组为63.0±9.1%,实验组为50.0±14.1%,P=0.045;Survivin:对照组为94.0±9.3%,实验组为77.0±11.8%,P=0.006)。4.HL-60细胞的CD11b和CD14表达在与MSC共培养后显著升高(对照组为阴性,实验组为25.0±3.2%)5.HL-60细胞经过Survivin与CD11b单克隆抗体双标后,发现一群CD11b阳性细胞, Survivin阴性表达的细胞,比例在16.0±4.9%。6.形态学分析,有部分细胞向中晚幼细胞以及单核细胞分化,分化率为18.0±9.0%。7.与MSC共培养处理后的HL-60细胞吞墨实验阴性。第二部分1.第14天CFU-F个数为:白血病组为20.0±2.1个/107MNC,非白血病组为25.0±3.0个/107MNC,CR白血病组为23.0±4.1个/107MNC。白血病组MSC的最少,三组比较差异显著,P=0.01,其他两组比较差异不显著,P>0.05。2.各组MSC的融合时间:白血病组为26.0±3.0天,非白血病组为21.0±1.0天,CR白血病组为22.0±2.0天。白血病组融合时间最长,三组比较差异显著(P<0.01)。3.经过筛选传代后的各组MSC增殖状态无差异。在第3、5、7天对各组进行细胞计数比较,P值均大于0.05,无差异。4.各组MSC的细胞形态在光镜水平下无差异。5.各组MSC的CD105、CD106均为高表达,CD45表达阴性,各组的CD105和CD106表达比较,P值分别为0.37、0.50,无差异。各组MSC的G0/G1期细胞比例为:白血病组为89.9±4.0%,非白血病组为90.2±3.0%,CR白血病组为91.0±3.0%,三组比较无差异(P=0.79)。各组MSC的DI值都在0.9-1.1范围之内。6.与各组MSC共培养后,HL-60的细胞计数:在第5天和第7天对各组比较无差异,P值分别为:0.77、0.96。7.与各组MSC共培养后,HL-60细胞周期分布、Survivin表达和CD11b表达比较无差异,P值分别为:0.89、0.08、0.19。8.HL-60细胞与各组MSC共培养后,细胞的形态皆向成熟方向转化,分化率分别为18.0±3、117.0±1.3、19.0±2.0,比较无差异(P=0.23)。结论第一部分1.骨髓MSC对HL-60细胞的增殖有抑制作用:①可能通过阻止细胞进入周期循环或者延缓周期进展速度来实现。②可以导致肿瘤细胞的分化,使细胞退出增殖周期。③这种抑制作用通过MSC分泌的细胞因子和与HL-60细胞的直接接触实现的。2.骨髓MSC可以引起HL-60细胞的凋亡,凋亡是伴随于分化的,与分化密切相关。细胞的凋亡伴随Bcl-2和Survivin的同时下调,推测两种凋亡相关蛋白有相关性。3.骨髓MSC对HL-60细胞有促进分化的作用,但是不能完成终端分化。4.骨髓MSC对HL-60细胞的增殖抑制和促分化作用,对于开辟白血病治疗新思路起到一定的作用。但MSC对HL-60的周期阻滞可能会使HL-60细胞得到化疗庇护。第二部分1.在白血病状态下的MSC可能没有发生本质改变。2.白血病状态下的MSC同样可以抑制白血病细胞增殖促进分化。3.MSC在白血病的发病和发展中尚未看到发挥重要作用。4.白血病状态下的MSC自体回输是安全的。