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坏死性小肠结肠炎(NEC)是一种严重的新生儿肠道炎症性疾病,主要发生在早产儿,可造成较高的发病率和死亡率。在NEC的发病病因中最重要的是肠道结构性和免疫不成熟。目前多认为与肠道发育不成熟、喂养不当、致病菌定植和感染、缺血后再灌注损伤、炎症介质作用等有关,但NEC的发病往往是多因素共同起作用,触发肠道局部炎症级联反应而导致。但是,这个理论并不能完全解释NEC全部的病理生理过程。新近研究发现,机体存在一种新型的不同于1型和2型的效应T细胞—辅助性17细胞亚群,命名为TH17细胞,TH17细胞的产生依赖于肠道正常菌群的存在,是肠道先天性免疫的重要组成部分。TH17细胞及其细胞因子IL-17A、IL-6的适量表达对维持肠道免疫功能起重要作用,但是过度表达则损坏肠道免疫功能。近年来,益生菌增强新生儿先天性和获得性免疫功能的作用得到了越来越多的肯定。本实验通过新生小鼠坏死性小肠结肠炎模型研究干酪乳酸杆菌对TH17细胞、IL-17A、IL-6表达的影响,初步探索Th17细胞和IL-17A,IL-6等在NEC发病机制中的作用及干酪乳酸杆菌对NEC的预防和保护作用。 目的:研究干酪乳酸杆菌对新生小鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)模型TH17细胞、IL-17A和IL-6的影响,并探讨其免疫调节作用的可能机制。 方法: 1.动物:60只新生的SPF级BalB/C小鼠,雌雄不限,购自广东省实验动物中心,体重在1.87～2.39g,饲养于广州医学院动物中心无特定病原体(SPF)环境中。 2.分组方法:对所有新生小鼠进行编号,然后查随机数据表,对所有的编号进行分组,随机分入NEC组(A组)、NEC+益生菌组(B组)、空白对照组(C组)及单纯益生菌组(D组),每组15只。B、D组出生后即给予干酪乳酸杆菌活菌悬液(1×108CFU/次,2次/日)口服,共3周。 [1]B、D组:出生后即给予干酪乳酸杆菌活菌悬液0.1ml/次(1×108CFU/次,2次/日)口服,共3周。平时继续正常母鼠喂养。 [2]对照组:经口给予等热卡的乳饮品,每只0.1ml/次,平时继续正常母鼠喂养。 3.干酪乳酸杆菌:由广州益力多乳品有限公司提供。 4.喂养方法:一周内新生小鼠,取新生儿密闭静脉留置针1根,消毒后将针芯拔出,一边接1ml注射器,吸取配方乳,将留置针前的软管以医用石蜡油润滑后,然后将针头由动物口腔侧面插入,避开牙齿,在喉咙处给药即可,共0.1ml;一周后的小鼠,在1ml注射器前端安装上灌胃针(8号),经小鼠口腔插入胃内,然后注射0.1ml乳饮品,每天注射两次,各组喂养3周,然平时继续正常的母鼠喂养。 5.NEC动物模型处理: 5.1、造模:A、B组30只小鼠在第三周末予100％氮气缺氧90秒,4℃冷刺激10分钟,每天两次,共3天。最后一天予腹腔注射LPS(10mg/kg用生理盐水配成10mg/ml)造模。 5.2、标本获取:造模6h后用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔麻醉,固定于夹板上,从剑突下剪开皮肤及肌肉,暴露胸腔。生理盐水清洗心前区,再用酒精消毒三次后,用1ml无菌注射器刺入,收集全血约0.4ml于抗凝管中,迅速放入-70℃冰箱中保存,留待检测TH17细胞。然后迅速打开腹腔,在近回盲部0.5cm处剪断肠管,取远端肠道约0.5cm,放入PBS液中冲洗后置于中性甲醛溶液中固定,固定24h后进行病理切片。再取长度约2cm小肠组织,置于冻存管放入-20℃冰箱中保存,留待检测IL-17A、IL-6。 5.3、C、D两组动物标本获取:获取标本的时间和方法与模型组相同,具体步骤详见5.2。 6.病理评分:石蜡包埋,切片,采用苏木素-伊红(HE)染色做病理检测。根据Nadler标准进行病理学评分。 7.流式细胞术检测小鼠血液TH17细胞:EP管取100ul全血,经培养、离心、固定、孵育、皂素破膜、再加入适量抗体行细胞表面及胞内抗原染色等,于流式细胞仪进行检测。 8.ELISA检测小鼠肠组织悬液IL-17A、IL-6:将肠组织匀浆,离心后取上清液;根据小鼠ELISA说明书进行操作,根据光密度值计算含量。 9.统计学处理:应用SPSS18.0统计软件进行统计学处理,计量资料采用均值±标准差(X+S)表示,,多个样本间比较采用单因素方差分析,两组间样本均数的比较进行t检验,样本间多重比较用SNK-q检验,非参数检验使用K-W秩和检验,发生率采用χ2检验,TH17细胞、IL-17A、IL-6与病理评分的分析采用pearson相关分析。P<0.05表示差别有统计学意义。 结果: 1.新生小鼠存活情况:各组小鼠的3周内死亡率相比,差异无统计学意义。(P>0.01)。 2.各组小鼠体重变化:整个实验期间,各组小鼠在三周内的体重增加比较(分别为8.64±0.73g、9.08±0.86g、9.50±1.13g、9.13±0.89g),差异无统计学意义。(P>0.05)。 3.NEC组的TH17细胞、IL-17A、IL-6含量及肠组织病理评分均显著高于NEC+益生菌组、空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。 4.空白对照组与单纯益生菌组的TH17细胞、IL-17A、IL-6含量及肠组织病理评分比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 5.肠组织病理评分与TH17细胞、IL-17A、IL-6水平成正相关(r值分别为0.808、0.856、0.754,所对应的P值均<0.01)。 结论: 1.口服干酪乳酸菌不会增加新生小鼠的死亡率。 2.口服干酪乳酸杆菌对新生小鼠体重无明显影响。 3.TH17细胞及IL-17A、IL-6可能参与NEC的发病过程。 4.干酪乳酸杆菌可降低TH17细胞、IL-17A、IL-6含量及减轻新生小鼠NEC肠道病理评分。 5.干酪乳酸杆菌可能通过降低TH17细胞、IL-17A、IL-6含量改善肠道及机体免疫功能,从而减轻NEC严重程度。