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目的:以具有抗乳腺癌复发转移临床有效经验方“乳移平”为代表方剂,观察其配伍肺经引经药“桔梗”后对不同乳腺癌肺转移模型的作用,并从癌基因HER-2、CXCL12/CXCR4生物学轴及其下游P13K和NF-κΒ信号转导通路的角度出发,探讨中医方剂对乳腺癌肺转移的作用及其机理,为临床指导中医药抗乳腺癌肺转移提供实验依据。
方法：实验分组:乳移平组(基础方),乳移平配伍桔梗组、乳移平配伍川牛膝组(中医对照)、阿霉素组(西医阳性对照)、生理盐水对照组。细胞株:人乳腺癌肺高转移细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435。实验内容:分体内、体外两部分。1.体内实验:建立MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌肺转移模型;给药期间测量原位瘤体积生长曲线;计算瘤重、瘤重抑制率、肺重、肺重指数、肺转移灶定量分析;流式细胞仪测不同组原位瘤和肺组织细胞周期变化;ISH法测原位瘤和肺组织CXCL12、CXCR4、HER2mRNA的表达;EMSA法测肺组织NF-κΒ结合活性。2.体外实验:制备各药物组大鼠药物血清;不同组药物血清对MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞增殖(MTT法)和细胞周期(流式细胞仪)的影响;Transwell小室法测各组细胞趋化活性的影响;IHC法测各组细胞CXCL12、CXCR4、HER2蛋白的表达;Real-time PCR法测CXCL12、CXCR4、HER-2、FAK、P13K基因的表达;EMSA法测NF-κΒ结合活性。
结果：病理证实MDA-MB-231和MDA-MB-435乳腺癌模型各组实验动物肺脏存在100％肺转移,提示两细胞株乳腺癌肺转移模型建立。体内实验显示,乳移平、乳移平配伍桔梗在MDA-MB-231和MDA-MB-435两个乳腺癌肺转移模型中均显示出一定的抑制原位瘤生长的作用(与对照组比较,P＜0.05,两药物组间比较,P＞0.05)。各药物组肺转移抑制率由弱到强依次是乳移平配伍川牛膝组、乳移平组、乳移平配伍桔梗组、阿霉素组。与乳移平单方比,乳移平配伍桔梗后可进一步分别提高MDA-MB-231模型肺转移抑制率1.31％和MDA-MB-435模型肺转移抑制率26.44％。乳移平配伍川牛膝在两个乳腺癌肺转移模型中均未显示出明确的抗乳腺癌肺转移作用(与对照组比,P＞0.05)。
体内原位杂交实验显示,在MDA-MB-231乳腺癌肺转移模型中,乳移平组可下调原位瘤中CXCl12、CXCR4、HER-2及肺组织中HER-2 mRNA的表达;乳移平配伍桔梗组可下调原位瘤中CXCL12、CXCR4、HER-2及肺组织中CXCL12、CXCR4 mRNA的表达;阿霉素组可下调原位瘤中CXCL12、CXCR4和HER-2 mRNA的表达,对肺组织中CXCL12、CXCR4和HER-2 mRNA的表达均无明确下调作用;乳移平配伍川牛膝组在原位瘤及肺组织中对CXCL12、CXCR4和HER-2均无影响。在MDA-MB-435乳腺癌肺转移模型中,乳移平组可下调原位瘤中CXCR4及肺组织中CXCL12 mRNA的表达;乳移平配伍桔梗后可下调原位瘤中CXCL12、CXCR4及肺组织中CXCL12、HER-2 mRNA的表达;阿霉素组可下调原位瘤中CXCL12、CXCR4、HER-2及肺组织中CXCR4、HER-2 mRNA的表达;乳移平配伍川牛膝组可下调原位瘤中CXCL12 mRNA的表达,对余基因无调节作用。
体外趋化活性实验显示,各药物组作用乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435后均能不同程度抑制肿瘤细胞的趋化活性,由强到弱依次为阿霉素组、乳移平配伍桔梗组、乳移平配伍川牛膝组、乳移平组。其中,乳移平配伍桔梗后抑制肿瘤细胞的趋化活性作用优于乳移平单方(P＜0.01);乳移平配伍川牛膝后也显示出一定的抑制肿瘤细胞趋化活性的作用,其作用优于乳移平单方(P＜0.01)。
体外实时定量PCR结果显示,乳移平组、乳移平配伍桔梗组和阿霉素组药物血清可不同程度下调MDA-MB-231和MDA-MB-435乳腺癌细胞株CXCL12、CXCR4、P13K和HER-2的表达。在MDA-MB-231细胞中,乳移平配伍川牛膝组可下调CXCR4、P13K和HER-2的表达,乳移平、乳移平配伍桔梗和川牛膝组可上调FAK的表达(乳移平组上调FAK作用最显著)。与乳移平单方相比,乳移平配伍桔梗后对CXCL12及CXCR4基因的表达有进一步的下调作用(P＜0.05)。在MDA-MB-435细胞中,乳移平配伍川牛膝组可下调P13K和HER-2表达,乳移平、乳移平配伍桔梗组可上调FAK表达。其中,与乳移平单方相比,乳移平配伍桔梗后对CXCL12和P13K基因的表达有进一步的下调作用(P＜0.01)。
EMSA实验显示,在未经药物干预的乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-435中均能观察到NF-κΒ的高活化表达。各药物组含药血清作用MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞株均出现不同程度的抑制NF-κΒ活化表达的作用,其中阿霉素抑制NF-κΒ活化作用最明显,乳移平配伍桔梗和乳移平单方也显示出良好的抑制活化作用。
结论：
1、MDA-MB-231和MDA-MB-435乳腺癌肺转移模型体内实验证实,基于痰毒瘀结病机和散结解毒治则而确立的临床经验方剂“乳移平”具有一定的抗乳腺癌及抑制乳腺癌肺转移的作用。
2、乳移平配伍肺经引经药“桔梗”后可进一步抑制乳腺癌肺转移实验动物模型肺转移的发生和发展。
3、乳移平及乳移平配伍肺经引经药“桔梗”可以调节CXCL12/CXCR4生物学轴及其介导的P13K和NF-κΒ信号转导通路,对癌基因HER-2的表达也有一定程度的下调作用。
4、乳移平及乳移平配伍肺经引经药“桔梗”可下调CXCL12、CXCR4、P13K和HER-2的表达,其中乳移平配伍桔梗后可进一步下调CXCL12、CXCR4和P13K的表达;乳移平配伍川牛膝未显示出明确的抗乳腺癌肺转移的作用;阿霉素主要通过下调HER-2的表达而起到抗乳腺癌以及乳腺癌肺转移的作用。
5、体外实验显示,乳移平及乳移平配伍桔梗可以影响乳腺癌细胞的细胞周期变化、抑制肿瘤细胞的增殖能力,同时亦可抑制具有乳腺癌肺高转移肿瘤细胞的趋化活性能力,说明中药方剂乳移平及乳移平配伍桔梗影响了乳腺癌细胞的增殖、迁徙、转移。