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多管藻(Polysiphonia urceolata Grev)是海洋大型红藻之一,红藻的藻胆体以超分子复合体形式附着在类囊体膜上作为光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ,PS Ⅱ)的捕光色素蛋白复合体为PSⅡ传递光能。
目前,光合作用光反应机制研究以原核蓝藻、绿色植物等为主要研究对象,捕光色素复合体研究主要在蓝藻、绿藻及高等植物中进行。红藻色素-蛋白复合体研究远落后于蓝藻、绿藻及高等植物。比较深入的研究工作主要在单细胞红藻-紫球藻(Porphyridium cruentum)中进行。红藻藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin,AP)研究更少。红藻藻胆体特征对深入认识其结构、功能及光系统进化非常重要。
本研究围绕多管藻藻胆体的分离纯化方法及藻胆蛋白的性质等进行了研究。采用两次蔗糖密度超速离心法分离纯化了多管藻藻胆体,确立了高效制备多管藻藻胆体的方法;利用层析法及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化了多管藻藻胆体中含量较高的藻红蛋白(phycoeryanin,PE)和含量较低的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白;研究了纯化的藻胆蛋白的光谱特性、等电点等,提出了藻胆蛋白在藻胆体中的聚合模式。
主要研究内容和结果如下:
1.多管藻藻胆体分离纯化
利用超声破碎,增溶,两次蔗糖密度梯度超速离心分离纯化藻胆体。结果表明以终浓度为2％(v/v)的NP-40增溶1.5h,用1.Omol/L-2.0 mol/L蔗糖密度和1.0mol/L蔗糖进行两次蔗糖密度梯度超速离心(138000xg,3.5h),获得多管藻的完整藻胆体(F675/F576=5.25),多管藻完整的藻胆体粒径在210nm左右。
2.藻胆蛋白分离纯化
比较了分离纯化多管藻R-红蛋白(R-PE)的不同方法。结果表明先经过Sephadex G-150分子筛柱层析,再经离子交换柱层析是纯化多管藻藻胆体中R-PE的最有效手段,可使其A565/A280=4.95。
多管藻-藻蓝蛋白(R-PC)经过Sephadex G-150分子筛柱层析和离子交换柱层析后,再经过非变性聚丙烯酰胺电泳(7％(w/v),pH7.5的分离胶,3％(w/v),pH5.5的浓缩胶)纯化,使R-PC的A618/A280=5.25。
R-PE和R-PC离子交换柱层析的洗脱条件分别是:R-PE采用0-400 mmol/L的NaCl溶液(25mmol/L的PBS缓冲液配制)共500 ml进行梯度洗脱;R-PC用50-400mmol/L的NaCl溶液(25mmol/L的PBS缓冲液配制)共500ml线性梯度洗脱。
R-PC离子交换后,分别用400mmol/LNaCl溶液和1.5mol/L NaCl溶液洗脱离子交换柱,又洗脱下两个组分,分别进行非变性聚丙烯酰胺电泳(5％(w/v),pH7.5的分离胶,4％(w/v),pH5.5的浓缩胶),可分离出别藻蓝蛋白。
3.藻胆蛋白的特征分析
对纯化的R-PE,R-PC和AP进行了光谱性质,等电点,分子量等分析。结果如下:
R-PE的等电点在pH4.7左右;分子量为247kDa;SDS.PAGE的结果显示R-PE有α,β,γ,γ四种亚基(SDS-PAGE的条件为13-21％(w/v),pH9.0的分离胶和4％(w/v),pH6.8的浓缩胶);R-PE有两种不同的六聚体形式(α17.6 β19.2)3γ29.5(α17.6 β19.2)3和(α17.6 β19.2)3γ31.0(α17.6 β19.2)3,两种聚合体的等电点非常接近;变性等电聚焦电泳结果显示R-PE亚基的等电点在pH5.0-5.8之间,α/β的等电点为pH5.0和pH5.8。
R-PC的等电点在pH5.7;SDS-PAGE的结果表明R-PC有α、β和β三种亚基,没有γ亚基和无色多肽(SDS-PAGE的条件为12％-21％(w/v),pH8.8的梯度分离胶和4％(w/v),pH6.8的浓缩胶);R-PC两种不同的六聚体形式(α17.5 β21.3)6和(α17.5 β22.6)6;R-PC的α/β亚基的等电点为pH5.1和pH5.2。
AP的等电点在pH5.5,SDS-PAGE的结果表明AP有α、β两种亚基(SDS-PAGE的条件为13％(w/v),pH 9.5的分离胶和4％(w/v),pH6.8的浓缩胶);经两次非变性电泳透析得到的Apl和由400 mmol/L NaCl洗下组分经非变性电泳得到的AP2有两种无色多肽,它们都有两种聚合体形式(α17β18.5)3L1和(α17β18.5)3L2,由1.5 mol/L NaCl洗下组分经非变性电泳得到的AP3没有无色多肽,只有一种聚合体形式(α17β18.5)3。
研究结果为深入了解大型红藻藻胆体中藻胆蛋白特征、藻胆体结构及其与蓝藻、单细胞红藻藻胆体的差异;为藻类叶绿体进化,光合作用机理及光系统的微观结构研究提供有价值的研究基础,为海洋红藻的应用提供理论依据。