仿生纤维膜用于循环肿瘤细胞的捕获和释放研究

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从外周血中检测分离循环肿瘤细胞(CTCs)对于癌症的早期诊断、术后监测和转移机制研究具有重要意义。然而,由于血液中CTCs数量极其稀少以及其它血液成分容易发生非特异性粘附,并且目前释放策略多采用侵入性方法会破坏细胞活性,导致CTCs检测存在捕获效率低、捕获纯度低和细胞活性低等问题。纳米纤维具有较大的比表面积可以提供更多的接触位点,其三维拓扑结构可以高度模仿细胞外基质(ECM)结构,两者的协同作用可以增强细胞与材料之间的识别作用。一些高分子刷与细胞膜的磷脂双分子层结构高度相似,并可以作为有效的防污屏障抵抗其它血液成分的非特异性粘附。红光是一种对细胞友好的刺激方式,并且具有时空可控、操作简单等特点,因此在生物医学领域得到了广泛的应用。受这些工作启发,本论文拟将纳米纤维膜、高分子刷和红光响应单元有机结合起来,从而构筑一种能够同时模仿ECM和细胞膜结构的双重仿生功能纤维膜,用于实现CTCs的高效捕获和红光刺激下的无损释放。首先,合成了四甲氧基偶氮苯(mAzo)。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振氢谱(~1H-NMR)对其结构进行了表征,结果证明了mAzo的成功合成。利用紫外-可见光吸收光谱(UV-vis)测试了其光致异构的性质,结果表明mAzo在620 nm的红光和470 nm的蓝光下能够成功实现顺反异构的转变。通过UV-vis也证明了mAzo与羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)的主客体相互作用。随后,构建了具有双重仿生结构的功能纤维膜。通过静电纺丝技术制备了尺寸为250±50 nm的聚己内酯(PCL)纳米纤维膜(PNFs),之后通过表面引发原子转移自由基聚合(SI-ATRP)方法在PNFs上依次接枝了聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(PMPC)和聚甲基丙烯酸(PMAA)高分子刷,并以mAzo和CM-β-CD的络合物为桥梁结构固定3-氨基苯硼酸(APBA)。通过扫描电镜电子显微镜(SEM)、X射线光电子能谱(XPS)及水接触角(WCA)分别对纳米纤维膜的形貌、化学结构和润湿性能进行了表征,证明了功能纤维膜的成功制备。最后,考察了功能纤维膜对细胞悬浮液和血液中的CTCs检测效果。通过细胞毒性实验和血小板粘附实验分别考察了材料的细胞相容性和抗污性能,结果证明功能纤维膜具有较好的细胞相容性和抗血小板非特异性粘附性能。以人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(Hep G2)和人宫颈癌细胞(He La)为研究对象考察了材料对不同癌细胞的广谱捕获性能,结果表明捕获效率均在88.7%以上。随后考察了捕获细胞在红光刺激下的释放行为,结果表明捕获癌细胞的释放效率随着红光照射时间增加逐渐增大,10 min后的释放效率即达94.1%,并且释放后的细胞活性高达93.6%。荧光显微镜和SEM结果证明释放后的细胞保持了完整的形貌并且显示出良好的增殖能力。最后以模拟临床样本和癌症患者血液样本为研究对象,系统考察了功能纤维膜对实际样品中CTCs的分离性能。在模拟血液样本中,材料对低浓度细胞(100-3000个细胞/m L)的检测呈现出高灵敏度。在临床癌症病人血液样本中,通过免疫荧光染色鉴定捕获细胞的纯度高达91.7%,在16例癌症患者中成功检测到了14例样品中的CTCs。
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