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高羊茅是主要的多年生冷季型草坪草,具有耐旱、耐瘠、抗病力强、适应性广等优良特性,在我国很多地方的城市绿化和运动场地的建设中应用广泛,是国内主要应用的草坪草之一。高羊茅生长季出现生殖枝,抑制新枝形成,对草坪质量及其持久性有较大影响。研究春化与光周期调控相关基因的分子特征,探索抑制生殖生长的分子育种新途径,对坪用型高羊茅品种改良具有重要意义。关于高羊茅基因克隆及分子特征的研究报道较少,与春化和光周期调控相关基因的克隆更未见报道。本研究以坪用型高羊茅新品种“黔草1号”为材料,综合运用同源扩增、cDNA末端快速扩增、实时荧光定量PCR、绿色荧光蛋白亚细胞定位等技术,研究春化基因FaVRN1、光周期调控基因(?)FaCONSTANS、SVP类似基因FaVRT-2和腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因FaSAMDC的分子特征,在不同春化和光周期处理条件下的差异表达,并构建靶向FaVRN1与1FaCONSTANS基因的RNA干扰表达载体。主要结果如下：1.高羊茅春化与光周期相关基因的分子特征高羊茅春化基因FaVRN1的cDNA序列全长1222 bp,开放阅读框位于152-889 bp,编码245个氨基酸,具有典型的MADS-box、K-box结构域,及许多磷酸化位点。与其他禾本科植物春化基因VRN1编码蛋白序列比较,同源性都在90%以上,具有高度保守性。高羊茅光周期调控基因FaCONSTANS的cDNA序列全长1557 bp,开放阅读框位于166～1296 bp,编码376个氨基酸,氨基端具有B-box型锌指结构域,碳端具有CCT(CO, CO-like, TOC1)结构域。与其他植物光周期调控基因CONSTANS的编码蛋白序列比较,B-box1特别保守,B-box2高度异化,缺乏3个保守的半胱氨酸残基。高羊茅SVP类似基因FaVRT-2的cDNA序列全长1111 bp,开放阅读框位于114-794bp),编码226个氨基酸,编码蛋白由MADS(M)结构域、Intervening (I)结构域、Keratin-like (K)结构域(?)(?)C-terminal (C)结构域组成,属于MIKC-typed MADS-box基因。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,FaVRT-2与黑麦草、大麦、小麦VRT-2蛋白亲缘关系最近,属于StMADS11类调控因子。高羊茅腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因FaSAMDC的cDNA全长1964 bp,微型上游阅读框、小型上游阅读框和主阅读框3个开放阅读框,分别位于226～234 bp、234～380 bp和555～1742 bp,微型上游阅读框和小型上游阅读框存在一个碱基重叠,主阅读框编码395个氨基酸,含有两个保守结构域：酶原剪切位点结构域和SAMDC蛋白快速降解有关的PEST结构域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,FaSAMDC与其他单子叶植物SAMDC蛋白的亲缘关系较近。2.高羊茅春化与光周期相关基因的差异表达春化条件下,春化基因FaVRN1基因的表达随处理时间延长逐渐增加。非春化条件下,FaVRN1基因的表达随处理时间延长而降低。FaVRN1基因在春化条件下的表达水平远高于非春化条件,说明FaVRN1基因的表达受春化条件正调控。SVP类似基因FaVRT-2的表达在春化和非春化处理条件均是由低到高再降低,都出现一个表达峰,但春化条件下的表达峰比非春化条件下早14d,表明春化处理对FaVRT-2基因的表达有促进作用。在长日照和短日照处理条件下,光周期调控基因FaCONSTANS在1个光周期内表达均是由低到高再降低,长日照条件下FaCONSTANS基因的表达高峰在有光照时出现,短日照条件下FaCONSTANS基因的表达高峰在黑暗中出现,但短日照处理条件下的表达峰比长日照处理条件下表达峰早2 h,约高2.3倍。由此说明,FaCONSTANS基因的表达受光周期调控,与生物钟控制的昼夜节律有关。在长日照和短日照处理条件下,腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因FaSAMDC都具有3个表达峰。短日照处理条件下的表达峰比长日照处理条件下表达峰早几个小时,但峰高低于长日照条件。由此说明,1FaSAMDC基因的表达受光周期调控,与生物钟控制的昼夜节律有关。3.亚细胞定位分别构建高羊茅春化基因FaVRN1、光周期调控基因(?)FaCONSTANS和SVP类似基因FaVRT-2基因与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体p-FaVRN1-hGFP. p-FaCONSTANS-hGFP和p-FaVRT-2-hGFP,基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达。结果表明,1FaVRN1、FaCONSTANS和FaVRT-2基因编码的蛋白产物都位于细胞核,符合它们作为转录因子特性。4.RNA干扰载体构建设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增出高羊茅春化基因FaVRN1与光周期调控基因FaCONSTANS各自351 bp长的外显子靶标序列,限制性酶切后以正向和反向插入到RNA干扰中间载体pBI121-M-INT内含子两端,分别构建RNA干扰表达载体pBI121-M-F-CONSTANS-INT-R-CONSTANS和pBI121-M-F-VRN1-INT-R-VRN1,限制性酶切鉴定正确。上述结果表明,春化基因FaVRN1、光周期调控基因(?)FaCONSTANS、SVP类似基因FaVRT-2和腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(?)FaSAMDC与高羊茅春化和光周期有关,进一步研究揭示其调控花期的分子机制后,可望通过对其表达水平的调控探索抑制高羊茅生殖生长的分子育种新途径。